[发明专利]一种古菌嗜热酯酶及(S)-酮洛芬的制备方法

摘要

本发明公开了一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，它的步骤如下：（1）设计一对引物，以Thermotogamaritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化得到古菌嗜热酯酶。本发明采用基因工程方法在大肠杆菌Escherichiacoli中克隆表达该酯酶基因，制备了该酯酶蛋白，蛋白纯度高（95%以上）。该酯酶最适反应温度和反应pH分别为70℃和5.0-5.5；具有较好的耐酸性，在70℃和pH4.5反应体系中处理60min可以保持50%左右活性。

主权项

一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，其特征在于：它的步骤如下：（1）设计一对引物: 上游[5’‑GCC CATATG GTT AAG CTG ATA ATC AAG‑3’]，下游[5’‑GAT GTCGAC TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC‑3’]，以Thermotoga maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21‑codonPlus(DE3)‑RIL，加入0.5 mol/L IPTG于37℃继续培养4 h，诱导表达的蛋白经过70℃热处理30 min，镍柱亲和层析，洗脱缓冲液：20 mM Tris‑HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole和分子筛Superdex‑200 (16/60) column，洗脱缓冲液：50 mM Tris‑HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl；洗脱速度为：0.5 ml/min，纯化后，得到古菌嗜热酯酶。