[发明专利]一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法

摘要

本发明公开了一种耐热α-葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法，以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)为菌种，对产α-葡萄糖苷酶的培养条件进行优化，确定实验最佳条件，在此基础之上，进行多批次的5L小型发酵实验和20L放大发酵实验，对收集的产物，采用离心、高压破壁法，得到α-葡萄糖苷酶粗酶。最后，以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附-交联法固定α-葡萄糖苷酶。本发明所得的α-葡萄糖苷酶是工业上生产低聚异麦芽糖的关键酶，作为主要酶制剂用于淀粉加工工业中的糖苷的转移提供了一种方法。

主权项

一种耐热α‑葡萄糖苷酶的制备与固定化的方法，其步骤是：（1）产α‑葡萄糖苷酶菌株的发酵①营养肉汁培养基：分别称取蛋白胨，牛肉提取物，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，使氢氧化钠调整至pH7.0，1.05Kg/cm²灭菌20min；②产酶培养基：分别称取蛋白胨，牛肉提取物，氯化钠，加入蒸馏水，混合均匀，自然pH，1.05Kg/cm²灭菌20min；③种子液的制备：将嗜热脂肪芽孢杆菌为菌种接种营养肉汁培养基中，在40‑50℃下振荡培养15‑25h，初始pH5.0‑7.0，装瓶量20‑40ml，接种量5‑20%，转速100‑300 r/min；（2）粗酶液的制备将种子液以10%的接种量，接种于产酶培养基，在45℃下振荡培养24h，于10000r/min离心20min，去除上清液，收集沉淀，将菌体沉淀使用高压破壁，即为α‑葡萄糖苷酶； （3）α‑葡萄糖苷酶的固定化①磁性壳聚糖微球的制备：称取纳米Fe₃O₄微球与0.01 g/mL的壳聚糖乙酸溶液混合后，进行超声分散10‑30min，边搅拌边缓慢加入液体石蜡和司盘‑80，室温下搅拌10‑30min，加入浓度为4%戊二醛溶液，在60‑80℃下充分搅拌1‑3 h，之后在70‑90℃水浴中，熟化1‑3 h，用磁铁收集得到的产物，最后依次用石油醚、丙酮、蒸馏水充分洗涤，在50‑70℃下真空干燥，得到磁性壳聚糖微球；②酶的固定化：将磁性壳聚糖微球加入三角瓶中，加入pH为7.0的磷酸‑磷酸钾缓冲液，充分混合1‑3h，将磁性壳聚糖微球取出，同时，将α‑葡萄糖苷酶溶于pH4.6的乙酸‑乙酸钠缓冲液中，得到浓度为0.8 mg/mL的酶液，然后将磁性壳聚糖微球加入到配制好的酶液中，再加入浓度为1%的戊二醛溶液，恒温振荡1.5 h，用磁铁收集磁性固定化酶，用缓冲液充分洗涤，在4℃下保存固定化的α‑葡萄糖苷酶。