[发明专利]一种脂肪细胞中自噬的监测方法

摘要

本发明公开了一种脂肪细胞中自噬的监测方法，成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但本发明经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，本发明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，本发明成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为我们以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

主权项

一种脂肪细胞中自噬的监测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养及诱导分化3T3‑L1前脂肪细胞获得成熟的脂肪细胞，用0.2%BSA‑DMEM孵育12h，裂解所获得的脂肪细胞，抽提其蛋白质；（2）采用BCA法对蛋白质进行定量，计算所获得的蛋白质样品的浓度，然后进行蛋白免疫印迹分析；（3）以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因编码区设计引物，根据载体质粒上的多克隆位点选择LC3编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游，上游引物的序列为：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为XhoⅠ；下游引物的序列为CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamHⅠ；PCR产物割胶回收，扩增出LC3b DNA片段，取双酶切后的的LC3片段和的pLVX‑IRES‑ZsGreen1进行T4DNA连接酶连接，培养产物，提取质粒，取酶切验证后的质粒进行测序分析；（4）用PlVX‑LC3‑IRES‑ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和VSVG转染293T细胞，收集病毒上清，进行慢病毒滴度的测定；（5）病毒转染成熟3T3‑L1脂肪细胞，共聚焦显微镜观察及电镜观察自噬体。