[发明专利]一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法

摘要

本发明公开了一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，包括获得川蔗23号遗传转化所需受体胚性愈伤组织；预培养及预处理胚性愈伤组织；携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备；工程菌液浸染胚性愈伤组织；胚性愈伤组织与农杆菌共培养；抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养；抗性植株PCR检测。在较低浓度的农杆菌液（OD600为0.1左右）与较短浸染时间（1.5～2min）并结合各种处理方法成功实现了甘蔗品种川蔗23号的遗传转化。

主权项

一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）胚性愈伤组织的获取：以川蔗23号的幼嫩叶鞘为外植体，经灭菌后切成幼叶卷，接种于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养，诱导胚性愈伤组织；（2）胚性愈伤组织的预培养及预处理胚性：将胚性愈伤组织转入胚性愈伤诱导培养基中，于25 ℃黑暗培养3～4 d；然后将胚性愈伤组织于浸染前在超净工作台风干处理30～45 min，至其微微干缩；（3）携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备：挑取携带pCAMBIA1301质粒与目的基因Bt的农杆菌菌株EHA105单菌落于农杆菌培养基上划线培养，48～72 h后刮取长0.5～1.0 cm的菌体，悬浮于农杆菌活化培养基内，其OD600为0.1，再置于28 ℃，180 rpm条件下振荡培养2 h，以诱导农杆菌vir基因的活化表达，此菌液即为转化工程菌液；（4）工程菌液浸染胚性愈伤组织：将预处理的胚性愈伤组织浸没于工程菌液中感染1.5～2 min，转到滤纸上吸干多余菌液；（5）胚性愈伤与农杆菌共培养：将浸染的胚性愈伤组织转入共培养培养基中，于23 ℃黑暗培养3～4 d；（6）抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养：将共培养后的胚性愈伤组织用无菌水清洗至无浑浊后，用含有羧苄青霉素(Car) 500 mg·L‑1的无菌水浸泡2 min，再用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后，接种于抗性胚性愈伤筛选培养基上，25 ℃黑暗培养15～20d，转入抗性芽筛选培养基上，25 ℃，2000 lx光照强度下培养以诱导芽的形成，当抗性芽长至5 cm左右时，转入生根筛选培养基上以筛选抗性完整植株；（7）抗性植株PCR检测。