[发明专利]利用45Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法

摘要

本发明公开了一种利用45Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，包括：油菜栽培、原生质体提取、原生质体活性鉴定、原生质体培养和原生质体钙离子吸收量测定。实验结果证实，转入耐热基因TR1的原生质体，低Ca2+浓度时提高了油菜对Ca2+的吸收，而在高Ca2+浓度时，可以减少Ca2+进入细胞。本发明提供的利用45Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，为研究培育对温度有更好调控能力的高产油菜奠定了基础。

主权项

一种利用45Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于主要包括以下步骤：（1）油菜栽培：将普通油菜和转基因TR1油菜种植在含有MS培养基的营养土中，于光照15‑17小时/天，温度23‑25℃条件下培养45‑55天，生长至真叶7‑10片，分别取两种油菜叶片提取原生质；（2）原生质体提取：将上述培养的两种油菜叶片切成0.4‑0.6mm丝状分别置于酶解液中，在24‑26℃酶解8‑10h，酶解后的细胞悬浮液经100‑120目尼龙网过滤，所得滤液经离心分离除去上清液，所得沉淀加入WI原生质体养护液，经离心洗涤得到原生质体；（3）原生质体活性鉴定：将步骤（2）提取到的两种油菜的原生质体用荧光素酶FAD染色观察，选取镜检细胞存活率＞90%的原生质体进行吸收钙离子实验；（4）原生质体培养：将步骤（3）镜检符合要求的两种油菜的原生质体分别置于含45Ca示踪剂的WI原生质体养护液中培养11~13h；（5）原生质体钙离子吸收量测定：将经步骤（4）培养得到的原生质体用浓度90~110mmol/L的EDTA洗涤液洗涤除去原生质体表面的钙，取0.1mL原生质体悬液经消解测量45Ca的计数，取0.1mL原生质体悬液用于原生质体数目计数，将剩下的原生质体悬液离心分离，取0.1mL上清液用于上清液计数，通过下式分别计算两种油菜的原生质体吸收钙离子量q以鉴别两种油菜原生质体吸收钙的差异： q = ( T - H ) S × k 其中：T为0.1mL原生质体吸收的钙离子实际计数，单位cpm，H为0.1mL上清液计数，单位cpm，S为0.1mL原生质体细胞数目，单位个，K为钙离子实际量与液闪计数比例系数，单位mol/cpm。