[发明专利]一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法

摘要

一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法，涉及鱼类染色体的制备方法。本发明是要解决大鳞鲃鱼染色体的制备方法的技术问题。本发明的方法如下：一、活体注射：两次活体腹腔注射植物血球凝集素(PHA)后，注射秋水仙素；二、取样：取头肾于NaCl生理盐水中洗涤、收集细胞；三、用柠檬酸钠和KCl混合溶液低渗；四、卡诺氏固定液冷冻固定；五、冷滴片法滴片；六、吉姆萨(Giemsa)染色液染色，即得大鳞鲃鱼染色体。本发明操作简便，结果稳定，可获得数目完整、分散良好、形态清晰的大鳞鲃鱼染色体中期分裂相标本。本发明应用于鱼类染色体的制备领域。

主权项

一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法，其特征在于大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法是按以下步骤进行的：一、活体注射：用5～10ppm苯氧乙醇将大鳞鲃鱼麻醉后称重，第一次活体腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，剂量与体重的比为7～12μg∶1g，16～20h后第二次活体腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，剂量与体重的比为5～10μg∶1g，作用4～6h后注射质量浓度为0.1％～0.2％的秋水仙素，剂量与体重的比为5～10μg∶1g，反应时间为2～4h；二、取样：将步骤一处理的大鳞鲃鱼剪鳃，水中放血10～15min，然后取出头肾于质量浓度为0.7％～0.9％的NaCl生理盐水中洗涤，用手术剪剪碎至生理盐水变浑浊为止，静置3～5min后用吸管收集上层细胞悬液于离心管中，在转速为1000～1500r/min的条件下离心5～10min，弃上清，收集细胞；三、低渗：向步骤二收集的细胞中加入低渗液，用吸管吹打至细胞均匀分散后，室温反应40～60min；其中低渗液由质量浓度为0.1％～0.5％的KCl溶液和质量浓度为0.1％～0.5％的柠檬酸钠溶液按体积比为1∶1～2混合而成；四、固定：将步骤三低渗的细胞在转速为1000～2000r/min的条件下离心5～10min，留0.3～0.5mL的上清液吹打成细胞悬液后，加入卡诺氏固定液固定20～30min；五、重复步骤四的操作1～2次后，在1000～1500r/min的转速下离心5～10min，弃上清液，沉淀物用卡诺氏固定液吹打成细胞悬液后置于‑18～‑20℃下冷冻过夜；六、冷滴片：把步骤五冷冻的细胞悬液离心后弃上清液，加入2～3mL的卡诺氏固定液混合均匀，取浸泡在冰水混合液中预冷的干净载玻片，分散滴上2～3滴细胞悬液，立即将载玻片在酒精灯火焰上方过3～5次，使染色体分散和展开，然后于室温下干燥；七、染色：将步骤六干燥的染色体载玻片用体积分数为10％～15％的吉姆萨染色液染色30～50min，自来水冲洗，自然干燥后完成染色体标本制备，即得到大鳞鲃鱼染色体。