[发明专利]一种稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法及其在养殖业中的应用，采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，37℃培养，经过三级放大而进行大规模发酵生产，经过聚乙二醇PEG4000和聚丙烯酸钠处理之后，制成活性稳定的枯草芽孢杆菌制剂。经过此方法制备的枯草芽孢杆菌，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，进入动物肠道存活率更高，定植能力更强，故将其作为饲料添加剂添加到饲料中，能够促进饲料中营养成分的吸收，改善肠道环境，提高机体免疫力和抗病能力。

主权项

一种稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：（1） 菌种活化：本发明采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.131，将‑80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种在种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，琼脂粉15g，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，活化；（2）制备一级种子：将活化的枯草芽孢杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；（3）配制固体发酵培养基：固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为3:1:1），葡萄糖5.0%，CaCO3 1.5%，MnSO4·H2O 0.04%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀。将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得二级种子。将二级种子按照10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得三级种子。可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照10%的接种量进一步扩大培养。将枯草芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×108 CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在90%以上；（5）稳定化处理： 将烘干的枯草芽孢杆菌固体发酵培养物，加入质量比为0.25%的聚丙烯酸钠和5%的PEG4000（预先溶解于水），搅拌混匀，晾晒或者65℃下加温处理60min以内干燥制得成品。