[发明专利]一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法

摘要

本发明涉及一种病毒的检测方法，更具体的讲是一种检测禽类及其产品中是否含有H4和H9亚型禽流感病毒的检测方法，包括以下步骤：设计两对引物、提取核酸、RT-PCR反应的反应体系、扩增条件、产物鉴定。本发明的有益效果是：在一个反应中同时鉴别诊断同一病毒的两种亚型，缩短操作时间；实验操作的反应液配制更为简单方便；避免了操作污染，因此本方法操作简便、成本更低，适合开发检测用RT-PCR试剂盒，用于H4和H9禽流感的临床鉴别诊断和流行病学调查。

主权项

1.一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，包括以下步骤：（1）设计引物：参照GenBank中H4和H9禽流感病毒的HA基因序列，设计两对引物H9-HA-F、H9-HA-R和H4-HA-F、H4-HA-R，用于扩增HA基因片段，序列为：H9-HA-F：5'-GCCTGCTAGATCAAGTAGAGG-3'；H9-HA-R：5'-TGGAACCCAATGCCCTCTTC-3'；H4-HA-F：5'-AGCAAAAGCAGGGGAAACAATGC-3'；H4-HA-R：5'-agtagaaacaagggtgttttttctc-3';H4扩增片段长度1738bp、H9扩增片段长度404bp;（2）提取核酸：将已知的H4和H9毒株样品等体积进行混合，并取200ul混合液加入1.5ml无RNA酶的离心管中，再加入1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000g离心15min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ulDEPC水充分溶解RNA，同时设H4和H9单一病毒作为对照;（3）RT-PCR反应的反应体系：2xBuffer25μl混合酶10UH4-HA-F引物(10μM)10～20pMH4-HA-R引物(10μM)10～20pMH9-HA-F引物(10μM)10～20pMH9-HA-R引物(10μM)10～20pMRNA模板10ulRNase-freeddH₂O补至50μl；（4）扩增条件：第一步50min50℃，1个循环；第二步94℃3min，1个循环；第三步94℃1.5min，52℃1.5min，72℃2min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环，4℃保存；（5）产物鉴定：取5L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果。