[发明专利]一种杉木遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种杉木遗传转化方法，包括：转化受体的建立，农杆菌菌液制备，侵染，脱菌培养和筛选培养。该杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。

主权项

一种杉木遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）转化受体的建立：取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23℃，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加10 mg/L Vc，0.1‑2.0 mg/L GA，2‑5mg/L ABA，0.5g/L CH，30g/L麦芽糖；（2）农杆菌菌液制备：活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28℃、220r/min振荡培液体养至OD600为0.6‑0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体；（3）侵染：将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置1‑3min后，置于23℃，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16~36h；（4）脱菌培养：用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4‑5mL；并放入23℃恒温培养箱暗培养；每隔21天继代一次，诱导30~60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加Vc 10 mg/L，GA 2‑8 mg/L，肌醇2‑10g/L，CH 0.5g/L，AC 2g/L，麦芽糖25g/L，水晶洋菜2.8g/L；（5）筛选培养：待杉木子叶胚成熟后，将其挑到DCR基本培养基上，在23℃下进行光照培养，培养基中加有200mg/L头孢霉素；21天后转移到加有100mg/L头孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养，每21天继代一次。