[发明专利]一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法

摘要

本发明涉及一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，是分别合成针对鸭甲肝病毒1型特异性引物SEQ1和SEQ2和针对鸭甲肝病毒3型特异性引物SEQ3和SEQ4，以待检样品RNA为模板，以SEQ1和SEQ3为引物反转录获得病毒cDNA，以上述两对引物为双重引物，以病毒cDNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可同时完成对鸭甲肝病毒1型和鸭甲肝病毒3型的快速鉴定。本发明根据RT-PCR技术原理，根据鸭甲肝病毒基因型与血清型相对应以及我国大陆地区只有两种血清型鸭甲肝病毒的特点，建立了双重RT-PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于1型和3型鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定。

主权项

一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT‑PCR方法，其特征在于包括以下步骤：A、通过对参考GenBank上已发表的DHAV‑1和DHAV‑3的序列进行比对，选择在DHAV‑1和DHAV‑3的多聚蛋白基因polyprotein gene的保守区分别设计一对针对DHAV‑1的特异性引物SEQ1/SEQ2和一对针对DHAV‑3的特异性引物SEQ3/SEQ4；SEQ1：5’‑CAA CTC GAC CAA TH(T/C/A)C CTG G‑3’，SEQ2：5’‑CCT GR(A/G)T GR(A/G)A CCA TTG TR(A/G)A CTG‑3’，SEQ3：5’‑GAA ATC TGC ACT CAA TGG AGA G‑3’，SEQ4：5’‑CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG‑3’；所有引物以无菌ddH2O配成25pmol/μl的浓度备用；B、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应；反应体系为：模板RNA4μl，SEQ1和SEQ3引物各1μl，5×M‑MLV Buffer2μl，浓度为10.0mM dNTPs0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，浓度为5U/μl RTase M‑MLV0.5μl，ddH2O0.75μl；反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，获得病毒cDNA；C、以病毒cDNA为模板进行PCR反应；反应体系为：35.1μl ddH2O，5μl Buffer，浓度为10.0mM dNTPs3μl，SEQ1和SEQ2各1.2μl，SEQ3和SEQ4各1.0μl，2μl cDNA模板，0.5μl Taq酶；PCR反应条件为：95°C5min；95°C50s，60°C50s，72°C40s，30个循环；72°C10min；D、对步骤C得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。