[发明专利]十字花科蔬菜根肿病菌荧光定量PCR检测技术及应用

摘要

本发明涉及一种根肿菌的荧光定量PCR检测技术及应用。用于快速准确地对十字花科蔬菜根肿病菌进行定量检测。该技术包括如下步骤：样本中DNA提取，特异性引物设计，应用以SYBRGreenI为基础的染料法荧光定量PCR检测技术对根肿菌的ITS区基因片段进行实时荧光定量PCR检测，构建标准曲线，计算待测样本中的ITS区基因片段拷贝数和根肿病菌的浓度。该检测技术操作简便、快速；特异性强、灵敏度高；检测灵敏度最高可达到24个拷贝数每个反应，并且可以同时进行大批量的样本分析。为病害的早期预测预报提供了良好的基础，因此，该方法适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。

主权项

一种十字花科蔬菜根肿病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：取田间自然发病土壤、发病植株、十字花科蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；特异性引物设计，在系统分析根肿病菌的ITS区、18SrRNA和5.8rRNA核酸序列系统发育的基础上，采用CLUSTAL，与根肿菌纲及土传病原菌的该区序列进行比较，寻找根肿病菌的特异性序列区域，设计特异性引物对1（PBF2/PBR2），引物对2（PBF3/PBR3），所述的引物对为：引物对1 正向引物5^，‑CTTGCGTGTCGCTGTATTC‑3^，             反向引物5^，‑ATAGGTTGGGGTAACTTGGC‑3^，；引物对2 正向引物5^，‑CTCACAACGATGAAGAAC‑3^，        反向引物5^，‑ACTCACAGCCAAAGACAAGC‑3^，3） 实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25µl，其中SYBR Premix Ex Taq(内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ) 12.5µl，浓度为10µmol/L的正义引物PBF2（PBF3）和反义引物PBR2（PBR3）各0.5µl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2µl，ddH₂O补齐至25µl；4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃  3min，接着进行40个循环，每个循环包括95℃  10s、60 ℃  30s；PCR完成后，按0.1℃ s^‑1升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；5）插入ITS区的pMD‑20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用根肿菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓度。