[发明专利]珍珠母蛋白N16的制备方法及其在制备防治骨科疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及珍珠母蛋白N16的制备方法以及在制备预防或治疗骨质疏松症、骨折等骨科疾病药物中的应用。本发明利用基因重组法在细菌中表达珍珠母蛋白N16，建立了N16的分离纯化方案。本发明通过细胞、动物实验证明，N16可抑制RANKL诱导前体破骨细胞RAW 264.7细胞的增殖与分化，促进前体成骨细胞MC3T3-E1细胞的分化成熟，增强成骨细胞的矿化功能，治疗去卵巢引起的骨质疏松症，可用于制备防治骨质疏松症、骨折等骨科疾病药物。

主权项

珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1.1从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；1.2根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物：引物N16F为5‑GGAATTCCATATGGCTGTCCATTATAAGTGC‑3’引物 N16R为5‑CGGGATCCTTAATTGTCAAACCGTTC‑3’其中下划线部位碱基分别为 NdeI 和BamHI限制性内切酶位点；1.3利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET3α上，并导入大肠杆菌BL21 (DE3) plysS，用于表达N16蛋白，其表达条件为当大肠杆菌BL21 (DE3) plysS生长到对数期，加入0.1～1 mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的表达6～16 h，收集表达菌体；1.4分离纯化步骤：将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经离子交换层析结合凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。