[发明专利]重组人胰岛素原的复性与纯化方法

摘要

本发明公开了一种高效体积排阻色谱（HPSEC）复性与同时纯化重组人胰岛素原的方法。包括（1）将含有胰岛素原的菌体细胞经超声波细胞破碎，缓冲液洗涤和溶解于强变性剂（如8mol/L或6-7mol/L盐酸胍），由此得到粗分离的重组人胰岛素原；（2）在优化的色谱条件下含有胰岛素原的变性抽提液直接进样，采用脲浓度线性梯度洗脱一步色谱所得的目标馏分rhPI的纯度可达到96%以上，质量回收率为56.8%；（3）将含有胰岛素原馏分进一步脱盐，由此得复性与纯化更高纯度和活性的馏分。本发明所述的方法得到的重组人胰岛素原可以经色谱柱上的酶切或溶液中酶切转换为胰岛素，并且该色谱过程操作简单，重复性高，易于规模化生产。

主权项

重组人胰岛素原的复性与纯化方法，其特征在于包括以下步骤：（1）在大肠杆菌中表达的重组人胰岛素原的菌体细胞经离心、超声破碎后分别用缓冲液I和II洗涤、离心溶解于强变性缓冲液中得到含有重组人胰岛素原的变性抽提液；所述缓冲液I为10～20  mmol/L PBS，0.5～1 mmol/L EDTA，pH 7.0～7.5；所述缓冲液II为0.5～2.0 mol/L脲，0.5～1 mmol/L EDTA，0.5～1.0 mol/L NaCl，10～20 mmol/L PBS，pH 7.0～7.5；所述的强变性缓冲液为6.0～8.0 mol/L脲，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；或6～7 mol/L盐酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；（2）将含有重组人胰岛素原的变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，然后用含20～40 mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相B线性梯度洗脱，流速为0.3～0.7mL/min，收集目标峰色谱馏分得到复性与纯化含重组人胰岛素原的色谱馏分；流动相A为：20～40 mmol/LPBS，0～8.0 mol/L脲，pH6.0～7.0；（3）将步骤（2）含重组人胰岛素原的色谱馏分直接进样，用0～10 mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱20～40 min，流速0.5～1 mL/min，得到重组人胰岛素原。