[发明专利]一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种识别HIV-1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，采用化学合成的方法获得b12抗体重链和轻链的可变区，用重叠PCR方法拼接得到scFv基因，利用原核表达系统，在室温和IPTG终浓度为0.5mM的条件下，诱导表达的b12-scFv大约有70％以可溶性蛋白的形式存在，用镍柱一步纯化便可获得高纯度的可溶性scFv，从1L培养液中能获得约2mg纯化的可溶性蛋白。本发明获得的b12单链抗体可溶性好，表达量尚佳，纯化过程简单，抗原结合能力好。用基因工程的方法在体外大量制备该抗体，可用于艾滋病的被动免疫防治；在基于包膜蛋白的HIV-1重组疫苗的设计中，也可用于b12抗原表位的检测，在HIV-1的被动免疫治疗和免疫原检测中具有一定的应用前景。

主权项

一种识别HIV‑1受体结合表位的可溶性单链抗体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：根据大肠杆菌密码子偏爱性将氨基酸序列翻译、优化成基因序列；依据b12抗体轻链及重链基因序列设计并合成引物；分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段；用重叠PCR的方法拼接得到完整的scFv基因序列；将scFv基因序列和pET28a分别用NcoI和XhoI双酶切，连接电泳回收片段，获得表达质粒；将重组质粒pET28‑b12‑scFv转化表达菌株BL21，在对数生长晚期加诱导剂，室温诱导表达后离心弃上清，沉淀用PBS缓冲液悬浮；超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，10％SDS‑PAGE分析蛋白表达及分布情况；取固化Ni‑NTA树脂装入层析柱中，用无菌水冲洗树脂，结合缓冲液平衡树脂，用超声波处理的细胞裂解液上清上柱后，依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液分别洗柱，后用咪唑洗脱缓冲液洗脱非特异结合的杂蛋白，200mM‑300mM咪唑洗脱并收集结合蛋白。