[发明专利]一种黄曲霉尿酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法

摘要

本发明公开了一种黄曲霉尿酸氧化酶（Uricase）在巴斯德毕赤酵母中的高效表达与纯化的方法。根据Uricase基因的核苷酸组成，将Uricase的双链DNA和α-factor信号肽的双链DNA，经过SOE-PCR将上述两条片段拼接，获得融合基因α-factor-uricase，将融合基因插入质粒pPIC3.5K，获得重组质粒pPIC3.5K-α-factor-uricase，电转化毕赤酵母，得高表达克隆株PichiapastorisSMD1168。表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶N端完全天然，无任何多余氨基酸，生产成本低，酶活性高，纯化步骤简便，收率大，纯度高，易于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。

主权项

一种利用巴斯德毕赤酵母高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤如下：a. Uricase DNA序列的扩增：合成碱基序列： P1：5’‑TCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGC‑3’P2：5’‑ AGCGAATTCTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG GCC ‑3 ’                   EcoRⅠ以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按RT‑PCR试剂盒的操作，进行RT‑PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DNA片段；      b. α‑factor信号肽编码序列的获得：合成碱基序列：      P3：5’‑ TATTCGAAGGATCCAAACGATGAG ‑3’                        BamHⅠ     P4：5’‑ TGCCGTAGCGGGCTGCTTTTACTGCGGATCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTCTTC ‑3’；以pPIC9K质粒为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α‑factor 信号肽编码DNA片段；c. 通过重叠延伸PCR进行α‑factor‑uricase 全基因合成： 以上述纯化后的α‑factor信号肽DNA片段和Uricase DNA片段为模板，加入P3，P2, 经SOE‑PCR方法扩增融合基因，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得α‑factor‑uricase 融合DNA片段，其序列为SEQ ID NO.1所示；d. 构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：用两种限制性内切酶双酶切步骤c获得的α‑factor‑uricase DNA融合片段的，所述的两种限制性内切酶是EcoR Ⅰ和BamHⅠ，纯化回收大片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pPIC3.5K，纯化回收大片段；连接回收的两组片段，得到含α‑factor‑uricase DNA片段的重组质粒pPIC3.5K‑α‑factor‑uricase，将重组质粒pPIC3.5K‑α‑factor‑uricase转化到大肠杆菌DH5α，制得5’端融合酿酒酵母α交配因子信号肽DNA的黄曲霉尿酸氧化酶全基因序列、即α‑factor‑uricase DNA序列的基因工程菌；e. 构建高效分泌表达黄曲霉尿酸氧化酶的毕赤酵母基因工程菌：从步骤d构建好的基因工程菌中抽提重组质粒pPIC3.5K‑α‑factor‑uricase ，经限制性内切酶SalⅠ酶切线形化后，电击转化毕赤酵母SMD1168，用G418浓度梯增法筛选得到多拷贝高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌；f. 黄曲霉尿酸氧化酶的表达：将构建好的高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌接种到YPD培养基中震荡培养过夜；取适量菌体在BMGY液体培养基中培养至OD600nm=2‑6时，1500‑3000g离心5‑10min，收集菌体,BMMY重悬菌体，使菌体初始浓度在OD600 =1.0‑1.5左右，震荡培养，每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%；在培养60‑72h后,得到可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶。