[发明专利]一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法

摘要

本发明提供了一种基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA含量的测定方法，包括单核苷酸多态性位点的筛选、血浆中位点DNA的提取、PCR扩增反应、胎儿DNA量的计算等步骤。该方法操作方法简单，采用基于单核苷酸多态性位点的扩增，避免了使用Y染色体遗传位点标记难以测定孕女胎的孕妇血浆中胎儿游离DNA的含量，应用广泛、准确度高。

主权项

一种非检测疾病目的的基于单核苷酸多态性位点的孕妇血浆中胎儿DNA量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，单核苷酸多态性位点的筛选：从单核苷酸多态性位点库中初步筛选出满足以下条件的单核苷酸多态性位点：(1)小等位基因频率在0.4‑0.5之间；(2)包含该多态性位点的DNA片段长度为50‑70bp；(3)位点上下游距离位点1‑60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点；(4)包含该多态性位点的DNA片段不是位于基因组变异数据库中拷贝数变异范围之内；(5)该多态性位点所处的片段在人类基因组范围内是特异的；(6)包含该多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45‑55％之间；其中，单核苷酸多态性位点的筛选可利用软件完成，包括以下步骤：a)从美国国立生物技术信息中心的单核苷酸多态性位点库中依据小等位基因频率数值过滤，提取出小等位基因频率在0.4‑0.5之间的单核苷酸多态性位点，提取出的片段长度为50‑70bp；b)将步骤(a)得到的单核苷酸多态性位点与人类基因组比较，提取出在人类基因组上是唯一的单核苷酸多态性位点；c)过滤步骤(b)得到的单核苷酸多态性位点，提取出位点上下游距离位点1‑60bp之间不包含任何单核苷酸多态性位点的单核苷酸多态性位点；d)将步骤(c)得到的单核苷酸多态性位点与美国国立生物技术信息中心的基因组变异数据库中拷贝数变异信息进行比较，过滤掉包含拷贝数变异信息的单核苷酸多态性位点；e)将步骤(d)得到的单核苷酸多态性位点与BWA索引数据库比较，并过滤，使剩余的单核苷酸多态性位点的DNA片段之间是相互兼容的，即该多态性位点的DNA片段之间，没有超过8bp的互补序列，同时各个多态性位点的DNA片段的GC含量应该在45‑55％之间；步骤二，血浆中包含位点序列游离DNA片段的提取：提取待测血浆中游离DNA，并分离出包括步骤一获得的位点序列的游离DNA片段；步骤三，PCR扩增反应：对步骤一中获得的单核苷酸多态性位点序列设计PCR引物，并利用PCR扩增步骤二分离的游离DNA片段，得PCR扩增产物；步骤四，胎儿DNA量的计算：对步骤三获得PCR扩增产物测序，并统计分析每个位点的片段数量，根据不同等位基因之间的比率，计算胎儿DNA的量，胎儿DNA含量的计算方法如下：用公式1计算所有符合条件的位点，得到胎儿DNA含量列表，用公式2取该列表的中值：公式1：Z_i＝X_i/(X_i+Y_i)i：符合条件的某一位点；X_i：i位点上胎儿等位基因数量；Y_i：i位点上母亲等位基因数量；Z_i：i位点上胎儿含量；公式2：μ＝Median(Z)μ：某一样本的胎儿DNA含量，取Z列表的中值。