[发明专利]一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺

摘要

本发明公开了一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，通过人工诱变育种，及工艺配方、培养条件的优化，使得原本在不同条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶后，经过一级种子液制备、二级种子液制备，最后于同一发酵罐内发酵培养。采用本发明的混合发酵工艺，抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%，节约成本200%。

主权项

一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）分别为L1、L2、L3，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，L1的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106；其特征在于，包含以下步骤：a）固体斜面培养：将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30～37℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25～30℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28～32℃，24～48h；b）理化因子诱变：将步骤a）中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为108～109个/ml（血球计数浓度）的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70%～90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30℃培养48h，至长出单菌落；c）摇瓶筛选：无菌条件下，将步骤b）中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；d）根据步骤c）中的二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30℃培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30℃培养22h，得摇瓶种子液；e）发酵培养：将步骤d）中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5℃，罐压：0.03～0.05MPa，pH值为6.3～6.6，流量1:0.3～1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。