[发明专利]一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用

摘要

本发明涉及一种植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建及应用。植物表达载体pGⅡ0229-GUS的构建方法，包括引物设计、PCR扩增和载体构建。本发明设计的特异引物通过PCR扩增获得的目的片段，包含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和NOS终止子，是一个完整的基因表达盒；植物表达载体pGⅡ0229-GUS只有7333bp，载体质粒小，含有左右边界，可以在农杆菌侵染转化上应用，也可以在基因枪轰击转化上应用。在遗传转化甘蔗时，GUS的瞬时表达率达到65%以上，适用于甘蔗，也适用于其他植物。

主权项

一种植物表达载体pGⅡ0229‑GUS的构建方法，包括引物设计、PCR扩增和载体构建；其特征在于：（1）引物设计：人工设计合成特异引物序列Forward primer: 5’‑ GCAAGCTTTTTCCCGCCTTCAGTTTAGC ‑ 3’Reverse primer: 5’‑ GCTCTAGAACACTGATAGTTTAATTCC ‑ 3’；　  （2）PCR扩增： PCR反应体系是10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2.0 μl，10 μmol/L的Forward primer 1.0 μl，10 μmol/L的Reverse primer 1.0 μl，5 U/μl的Ex Taq 酶0.125 μl，100 ng/μl的DNA模板1.0 μl，加ddH2O至终体积25 μl；PCR程序是95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min；所述DNA模板是以pCAMBIA2301质粒为DNA模板；（3）载体构建：将步骤（2）的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ，并将获得的目的片段Ⅰ用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅱ，同时将pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI进行酶切，回收目的片段Ⅲ，将回收的目的片段Ⅱ和目的片段Ⅲ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得pGⅡ0229‑GUS载体；所述目的片段Ⅰ是指用特异引物扩增出的含有35s启动子、GUS瞬时表达基因和nos终止子的核酸片段；目的片段Ⅱ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切目的片段Ⅰ后2927bp的核酸片段；目的片段Ⅲ是指用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切pGreenII0229质粒DNA后4406bp的核酸片段。