[发明专利]荧光定量PCR检测醋醅中五种菌的方法

摘要

本发明采用荧光定量PCR来检测醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的动态变化，为其他微生物群落的研究提供技术支持。

主权项

一种应用荧光定量PCR检测醋醅中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的方法，其特征及具体步骤如下：①设计、合成针对瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）的特异性引物；②对分离纯化得到的瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒分别对其培养液进行DNA提取；③分别以瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌的DNA为模板，以Lhe‑F/Lhe‑R、Lcr‑F/Lcr‑R、Lca‑F/Lca‑R、Lde‑F/Lde‑R和Lacid‑F/Lacid‑R为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收；④构建重组质粒，将目的片段与pMD19‑T Vector 连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入pMD19‑T Vector，验证成功的质粒作为荧光定量PCR的标准样品；⑤利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品；⑥荧光定量PCR反应体系和反应条件；⑦重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行定量分析。