[发明专利]适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法及其应用无效
| 申请号： | 201310120764.X | 申请日： | 2013-04-02 |
| 公开（公告）号： | CN103333916A | 公开（公告）日： | 2013-10-02 |
| 发明（设计）人： | 李明义;陈欢;刘阳;冯晶晶;单学强;张伦;郭春丽;李佳琪 | 申请（专利权）人： | 山东信得科技股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/91;C12R1/93 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 262200 山东省潍*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法以及在鸡新城疫病毒的增殖中的应用。本发明通过改进新城疫病毒培养方式、优化培养参数、筛选传代细胞，建立传代细胞疫苗生产工艺，生产工艺流程将大大简化，生产过程更加可控。 | ||
| 搜索关键词： | 适应 新城 疫病 增殖 bhk 细胞系 建立 方法 及其 应用 | ||
【主权项】：
一种适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系的建立方法，其特征在于包括如下步骤：(1)PCR扩增ST3GAL I片段：以如下引物：ST3GAL‑F：5′‑ATTTGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCACCGTCAGGAAAAGGAAC‑3′；ST3GAL‑R：5′‑CGTCTAGAGGTCATCTGCCCTTGAAAAAT‑3′。以pESG‑T‑ST3GAL I质粒为模板，PCR扩增ST3GAL I基因序列，收集1000‑1050bp的扩增引物；(2)重组质粒pcDNA3.1‑EGFP‑ST3Gal I的构建将扩增序列连接到pMD18‑T载体上得重组质粒pMD‑ST3Gal I，使用Not I、Xba I分别双酶切pMD‑ST3Ga I和pcDNA3.1‑EGFP，酶切产物在T4DNA ligase的作用下连接，得重组表达质粒pcDNA3.1‑EGFP‑ST3Gal I；(3)BHK细胞的转染BHK细胞在转染前一天接种，培养18～24h至70‑90％细胞汇合，使用转染试剂将重组质粒pcDNA3.1‑EGFP‑ST3Gal I转染BHK细胞；(4)抗性细胞克隆的筛选待转染20‑28h后，换用含有G418(700‑900ug/mL)的DMEM培养液进行筛选，2周后G418改为300‑500ug/mL维持剂量筛选，挑选抗性细胞集落，按有限稀释法进行单细胞克隆，得到适应鸡新城疫病毒增殖的BHK细胞系。
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