[发明专利]谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法

摘要

本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术，利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，分别依据代谢工程理论，进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究，合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径，得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。

主权项

1.谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于：所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332及大肠杆菌DH5α；所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10m1 LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml LB液体培养基；2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物P2：5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分：回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，SolutionI5，总体积10，在16℃连接过夜，用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI；所述L183Q定点突变，该突变过程如下：1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，M1：5’-TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’；M2：5’-TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3’，其中下滑线为突变位点；2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T-simple-Aro I为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增：反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer star HS酶，之后94℃30s，55℃1min，68℃8min35个循环后；72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；3)、Dpn I酶消化原始模板，PCR产物直接按下表体系加入Dpn I酶37℃消化4h，完成原始模板消化过程；4)、转化，将带缺刻的消化产物直接转化E.coli DH5α；5)、阳性克隆筛选，氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆；6)、重组质粒的鉴定，测序比对，测序结果与Aro I序列比对确定目的突变正确性，测序正确的重组质粒命名为pMD18T-simple-Aro I*。