[发明专利]谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法无效
申请号: | 201310130806.8 | 申请日: | 2013-04-10 |
公开(公告)号: | CN103233032A | 公开(公告)日: | 2013-08-07 |
发明(设计)人: | 刘俊梅;胡耀辉;李琢伟;王丹;王玉华;朴春红;于寒松;代伟长 | 申请(专利权)人: | 吉林农业大学 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;C12N15/54;C12N15/10 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 吉林省长*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | 本发明公开了一种高新生物技术,尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术,利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌为出发菌株,分别依据代谢工程理论,进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究,合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径,得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。 | ||
搜索关键词: | 谷氨酸 杆菌 合成 基因 克隆 l183q 定点 突变 方法 | ||
【主权项】:
1.谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法,其特征在于:所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332及大肠杆菌DH5α;所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆,该基因克隆步骤如下:1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取,谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10m1 LB液体培养基中,30℃摇床培养12h,次日2%接种量接入100ml LB液体培养基;2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成,根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID:1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物:上游引物P1:5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’;下游引物P2:5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’,其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点;3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增,以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板,进行降落PCR扩增:以P1,P2为引物,反应条件采用热启动PCR方式:95℃预变性4min,80℃pause加入Primer starHS酶,之后94℃30s,60℃40s,72℃120s2个循环;94℃30s,58℃40s,72℃120s2个循环;94℃30s,56℃40s,72℃120s2个循环;94℃30s,54℃40s,72℃120s2个循环;94℃30s,52℃40s,72℃120s2个循环;94℃30s,50℃40s,72℃120s20个循环后;72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾,反应结束后取5μl扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测;4)、PCR产物的回收,采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,回收的DNA贮存于-20℃,目的片段与克隆载体的连接,将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上,连接反应中各种反应组分及加样量重量比分:回收的PCR产物4.5,pMD18-T-simple载体0.5,SolutionI5,总体积10,在16℃连接过夜,用CaCl2法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞;5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选;6)、重组质粒的鉴定,采用碱裂解法提取质粒DNA,进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定;7)、重组质粒的核苷酸序列测定,对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养,制备成甘油菌,进行序列测定,测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI;所述L183Q定点突变,该突变过程如下:1)、合成酶突变位点的选择,合成酶的定点引物的设计,根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物,M1:5’-TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’;M2:5’-TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3’,其中下滑线为突变位点;2)、PCR扩增DAHP突变基因,以测序正确的重组质粒pMD18T-simple-Aro I为模板,以突变引物高保真循环PCR扩增,按下表体系扩增:![]()
反应条件采用热启动PCR方式:95℃预变性4min,80℃pause加入Primer star HS酶,之后94℃30s,55℃1min,68℃8min35个循环后;72℃延伸20min。反应结束后取5μl扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测;3)、Dpn I酶消化原始模板,PCR产物直接按下表体系加入Dpn I酶37℃消化4h,完成原始模板消化过程;
4)、转化,将带缺刻的消化产物直接转化E.coli DH5α;5)、阳性克隆筛选,氨苄抗性(100mg/L)、蓝白斑筛选阳性克隆;6)、重组质粒的鉴定,测序比对,测序结果与Aro I序列比对确定目的突变正确性,测序正确的重组质粒命名为pMD18T-simple-Aro I*。
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