[发明专利]一种新普鲁兰酶的制备和分离方法

摘要

本发明涉及一种新普鲁兰酶的制备和分离方法，其步骤包括：a.菌株培养基配方；b.菌株培养条件；c.新普鲁兰酶的分离方法；d新普鲁兰酶的柱层析分离。本发明制备的新普鲁兰酶性能稳定、酶活力高、分离纯化的新普鲁兰酶耐酸碱，耐高温，同时具有催化水解α-(1,4)–和α-(1,6)–糖苷键及催化二者间的相互转糖苷的双重作用，能大幅度提高淀粉转化率，同时还可增加淀粉用途，生产出新品种。新普鲁兰酶可广泛用于淀粉加工业特别是淀粉的生物转化加工领域，具有广阔的应用前景和显著的经济效益。

主权项

一种新普鲁兰酶的制备和分离方法，其步骤分为：1.试管斜面培养1.1试管斜面培养基配制：培养基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏2~5g，NaCl 3~6g，琼脂18~25g，NaH₂PO₄  0.1~0.5g，葡萄糖1~3g，蒸馏水0.8~1L，将以上试剂放入2L不锈钢容器中不断加热搅拌，温度至50~60℃全部溶解，并调整液体pH为5.0~7.0，将溶解后的液体分别装入15 mm × l50 mm规格的试管中，每只试管装入8~10ml，透气硅胶试管塞封口 后，在121℃，灭菌20~30 min后将试管放置10~15度角斜面上，待培养基凝固后备用；1.2菌种试管斜面培养：将嗜热脂肪芽孢杆菌在无菌条件下用接种针接入试管斜面培养基上，在培养箱中50℃～55℃条件下静置培养18~24小时，此时细菌菌落生长至全部覆盖培养基表层，菌种斜面培养完成，备用；2.菌种试管液体培养2.1试管液体培养制备：液体试管培养基配方：蛋白胨9~12g，酵母粉2~5g，牛肉膏2~5g，NaCl3~6g，NaH₂PO₄  0.1~0.5g，葡萄糖1~3g，蒸馏水0.8~1L；将以上试剂放入2L不锈钢容器中不断加热搅拌，温度至50~60℃全部溶解，并调整液体pH为5.0~7.0；将溶解后的液体分别装入15 mm × l50 mm规格的试管中，每只试管装入10~12ml，透气硅胶试管塞封口后121℃，20 ~30min 灭菌，待培养基冷却至常温后备用；2.2菌种试管液体培养：将嗜热脂肪芽孢杆菌在无菌条件下用接种针将斜面培养菌株接入试管液体培养基中，在培养箱中50℃～55℃条件下振荡培养培养20～36小时，振荡转速120~150r/ min，备用；3.产酶发酵培养3.1产酶发酵培养制备：培养基配方：蛋白胨10~15g，酵母粉5~8g，牛肉膏5~8g，NaCl 5~8g，NaH₂PO₄  0.1~0.5g，葡萄糖1~3g，蒸馏水1.0~1.2L；将以上试剂放入2L不锈钢容器中不断加热搅拌，温度至50~60℃全部溶解，并调整液体pH为5.0~7.0；将溶解后的液体分别装入500ml规格的三角瓶中，每只瓶装入150~200ml，纱布包裹的棉塞塞封口 ，牛皮纸包裹严实后121℃，20 ~30min 灭菌，待培养基冷却至常温后备用；3.2三角瓶发酵培养：将2.2备用的试管液体培养菌种在无菌条件下转接入三角瓶液体培养基中，在培养箱中50℃～55℃条件下振荡培养48～72小时，振荡转速180~200r/ min，得到嗜热脂肪芽孢杆菌发酵培养液；测定培养基菌密度吸收OD540_nm(1cm)≥2.0时结束培养；4.新普鲁兰酶的分离方法4.1菌细胞收集和破碎将3.2 得到嗜热脂肪芽孢杆菌发酵培养液经5000～8000g离心10~15min，收集上清的无细胞液备用；沉淀的菌细胞使用 50 mM pH6.0磷酸缓冲液（PBS）悬浮后移入细胞破碎机中，在800～1000Bar压力下0～4℃破碎1～5min，菌体破碎液经10000～12000g离心15~20min，弃去沉淀，收集上清的备用；4.2新普鲁兰酶粗酶液的制备取4.1无细胞液或菌体破碎后的上清液，分别用0.75～0.80mol的硫酸铵0～4℃盐析18～24小时，12000～15000g离心15~20min，弃去上清液，沉淀溶于pH6.0，50mM PBS中，透析去除硫酸铵，离心除去沉淀后得到新普鲁兰酶粗酶液；5.新普鲁兰酶的柱层析分离将4.2新普鲁兰酶粗酶液装入透析袋中，放入底部铺有聚乙二醇20000的平皿内，0～4℃浓缩，测定浓缩粗酶液的蛋白质含量和酶活力；用50 mM pH6.0 PBS对10mm×800mm DEAE‑52 纤维素离子交换层析柱平衡4～6小时，取浓缩粗酶液加入层析柱，用pH6.0，50mM PBS平衡至使用紫外分光光度仪在OD_280nm检测平衡洗脱液无蛋白吸收峰，再用含50mM /L NaCl的pH6.0，50mM PBS洗脱，流速0.8～1mL/min，自动部分收集器收集洗脱液，每管2~3mL，逐管测定蛋白质含量和酶活力，并计算酶的比活力，收集酶活部分，并经pH6.0，50mM PBS透析除去其他离子，聚乙二醇20000浓缩后得到纯化的新普鲁兰酶。