[发明专利]一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒

摘要

本发明提供一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒，对甲型流感病毒及H7N9型进行检测。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、阳性对照品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、阴性对照品。本发明根据甲型流感病毒、H7、N9的保守区序列设计特异性的引物和探针，引入RNaseP引物探针作为内参，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中检测甲型流感病毒及H7N9亚型流感病毒。该试剂盒设计合理，具有极高的特异性、灵敏性和重复性，可应用于甲型流感病毒H7N9亚型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查及发热呼吸道症候群中甲型流感病毒及H7N9亚型的流行病学的研究。

主权项

一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT‑PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT‑PCR反应液管（1）、酶混合液管（2）、引物探针混合液管（3）、4个标准品管（4）、4个阳性对照品管（5）、阴性对照品管（6）和盒体（7）组成，定量RT‑PCR反应液管（1）装有定量RT‑PCR反应液，酶混合液管（2）装有酶混合液，引物探针混合液管（3）装有引物探针混合液，4个标准品管（4）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管（5）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；其中定量RT‑PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；荧光定量RT‑PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物Influenza A‑F: 5’‑ GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC‑3’下游引物Influenza A‑R：5’‑ GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC‑3’特异性探针Influenza A‑P: 5’‑ROX‑AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT‑BHQ2‑3’上游引物H7‑F: 5’‑ GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT‑3’下游引物H7‑R: 5’‑ CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA‑3’特异性探针H7‑P: 5’‑FAM‑ ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA­‑BHQ1‑3’上游引物N9‑F: 5’‑ GCCCTGATAAGCTGGCCACT‑3’下游引物N9‑R: 5‑ ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA‑3’特异性探针N9‑P: 5’‑VIC‑ TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA‑BHQ1‑3’上游引物RNase P‑F: 5’‑ AGATTTGGACCTGCGAGCG‑3’下游引物RNase P‑R：5’‑ GAGCGGCTGTCTCCACAAGT‑3’特异性探针RNase P‑P: 5’‑CY5‑ TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG‑BHQ2‑3’ 所述标准品包括甲型流感病毒、H7、N9及核酶RNase P标准品，其保守区基因序列如下：甲型流感病毒标准品序列为：CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGGH7标准品序列为：CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTN9标准品序列为：GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGGRNase P标准品序列为：CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC 所述甲型流感病毒、H7、N9及RNase P的特异性探针分别采用ROX、FAM、VIC和CY5四种不同荧光标记。