[发明专利]牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用

摘要

本发明公开一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用。本发明以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板，得到bp26基因的上游同源臂，BLS基因、L7/L12基因和bp26基因的下游同源臂；将前述基因片段依次连接，得到片段Δbp26-BL；分别对pRE112和Δbp26-BL双酶切，连接，得到自杀性同源重组质粒；将该质粒导入S19-Δbp26菌株的感受态细胞中，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子，再将同源重组单交换子涂布于选择培养基上培养，获得牛布鲁氏菌重组菌S19-Δbp26-BL。该菌株具有良好的遗传稳定性，生长特性和毒力大小好，可作为一种标记疫苗株用于临床。

主权项

一种牛布鲁氏菌重组菌株S19‑Δbp26‑BL的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）自杀性同源重组质粒的构建①以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板做PCR扩增，用引物P1和P2扩增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4扩增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2扩增，得到BLS基因；用引物B3/B4扩增，得到L7/L12基因；P1：5’‑GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT‑3’；P2：5’‑CCTCGTGCTTGGACATAAAATCTCCTACAGGAAAAGTT‑3’；P3：5’‑AAGGTTGAACTCAAGTAAATAGCCGGGGTATGACG‑3’；P4：5’‑CGAGAGCTCGTGGCATCCCCTTGTTTC‑3’；B1：5’‑ATGTCCAAGCACGAGGC‑3’；B2：5’‑GGAACCTGGAGAGGCTCCGAATTTTTT‑3’；B3：5’‑AGCCTCTCCAGGTTCCGCTGATCTCGCAAAGATCGTT‑3’；B4：5’‑TTACTTGAGTTCAACCTTGGCG‑3’；②利用Overlap PCR的方法，首先将步骤①制备的BLS基因和L7/L12基因相连接，连接好的片段再与步骤①制备的bp26基因的上、下游同源臂进行Overlap PCR，得到了用于同源重组的目的片段Δbp26‑BL；③用SacI和KpnI分别对自杀性质粒载体pRE112和Δbp26‑BL基因片段进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Δbp26‑BL和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE‑Δbp26‑BL；（2）牛布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选①将自杀性同源重组质粒pRE‑Δbp26‑BL导入牛布鲁氏菌基因缺失株S19‑Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；同引物P1和P4将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养，松弛质粒抗性；②接着将同源重组单交换子涂布于TSA‑YE‑Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE‑Δbp26‑BL中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA‑YE‑Sucrose选择培养基上生长的菌落进 行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到牛布鲁氏菌重组菌S19‑Δbp26‑BL；所述的TSA‑YE‑Sucrose选择培养基的组成如下：胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+蔗糖，蔗糖的终浓度为质量体积比7%。