[发明专利]一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒

摘要

本发明提供了一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。所述含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的。向加入苯并[a]芘及基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接种产碱菌Alcaligenes sp.，培养20天后得到菌液，对菌液经过提取与纯化得了到含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒。本发明得到的含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒可以构建对苯并[a]芘具有降解功能的菌株，提高以苯并[a]芘为代表的多环芳烃污染物的生物降解效果，对于多环芳烃苯并[a]芘污染土壤及水体有应用潜力。

主权项

一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒，其特征在于，该降解质粒由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的，产碱菌Alcaligenes sp.的菌种保藏号为CGMCCNo.3638，其中，从产碱菌Alcaligenes sp.中提取与纯化含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒的具体方案为：(1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为：NH4NO3：1.7g·L‑1，KH2PO4：1.0g·L‑1，K.2HPO4：1.0g·L‑1，MgCl2：0.30g·L‑1，CaCl2·2H2O：0.15g·L‑1；微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O：55mg·L‑1，CuCl2：0.35mg·L‑1，H3BO3：11.0mg·L‑1，MnCl2·4H2O：45mg·L‑1，Na2MoO4·2H2O：5.5mg·L‑1，NiCl2·2H2O：4.5mg·L‑1，ZnCl2：4.5mg·L‑1；(2)在超净工作台中向体积为100mL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为1g/L的苯并[a]芘丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；(3)向步骤(2)中的锥形瓶内加入60mL按步骤(1)配制的液体培养基；(4)在超净工作台中挑取产碱菌Alcaligenes sp.，将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养20～22天；(5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液；(6)向步骤(5)中的离心管中加入10mL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋涡振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液分离出菌体；(7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为：50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷‑HCl，20mL0.25M EDTA，20mL0.9M KCl，10mL百分比浓度为2.0％的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2；然后加入2.2mgN‑乙酰胞壁质聚糖水解酶，在0～4℃条件下振荡10min后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55℃条件下水浴振荡1h，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液；(8)向由步骤(7)得到的上清液中加入1mL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在0～4℃条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液；(9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化；(10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为：5mL4.5M盐酸胍，10mL3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH7.0；在0～4℃条件下振荡15min， 在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体；(11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为：40mL10mM三羟基甲基氨基甲烷‑HCl，30mL3.0M NaCl，30mL1.5mM EDTA，pH8.5；在55℃条件下振荡20min，在10000r/min条件下离心5min；将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55℃水浴中放置10min，在10000r/min条件下离心5min；离心管中液体即为含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒溶液，在‑20℃保存备用。