[发明专利]一种构建降解组测序文库的方法

摘要

本发明公开了一种构建降解组测序文库的方法包括miRNA靶基因mRNA片段的分选、miRNA靶基因mRNA片段5’端的接头连接、miRNA靶基因cDNA的扩增步骤。本发明技术方案操作简单能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因，具有高效、快捷、直观、准确的特点。

主权项

1.一种构建降解组测序文库的方法,其特征在于，包括以下步骤：1）.miRNA靶基因mRNA片段的分选：将3’接头（3’Adapter序列：5’-TGGAA TTCTC GGGTG CCAAG G-3’）与靶基因mRNA片段的3’端退火互补，其反应条件是：将上述连接混合物于65℃保温3分钟，获得含有3’接头—mRNA连接产物的连接混合物；2）.将步骤1所获的连接混合物中的3’接头—mRNA连接产物连上5’接头（5’Adapter序列：5’-GUUCA GAGUU CUACA GUCCG ACGAU C-3’），反转录获得两端均带有接头的靶基因mRNA片段，其步骤是：a）.mRNA的5’接头连接:将上述反应体系于37℃保温1-2小时，之后置于冰上；b）.纯化:往反应体系中加入75μl H₂O无水乙醇，-80℃放置30分钟，16000g离心30分钟，去上清后冷冻干燥，加入19μl RNase Free H₂O；获得纯化的连接产物；c）.反转录:将上述混合物于25℃静置2分钟,加入1μl反转录酶,于25℃保温10分钟，再于42℃保温40分钟，最后于70℃保温20分钟；3）.miRNA靶基因cDNA的扩增：以两端均带有接头的靶基因mRNA片段为模板，利用引物（5’-AATGA TACGG CGACC ACCGA GATCT ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA-3’与5’-CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATC GTGAT GTGAC TGGAG TTCCT TGGCA CCCGA GAATT CCA-3’）进行PCR扩增，获得靶基因mRNA片段的降解组测序文库，其步骤是：①进行PCR反应：98℃变性45秒，10-15个PCR循环，98℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，72℃后续延伸1分钟，最后保存于4℃；②凝胶电泳回收：利用凝胶电泳分离PCR产物，切取预期大小分子并回收得到高通量测序用降解组文库。