[发明专利]从毛蚶中提取甾体化合物的方法

摘要

本发明公开的是从毛蚶中提取甾体化合物的方法。目前，对毛蚶的研究多集中在活性多糖、多肽及蛋白质等方面，迄今尚未见有从毛蚶中提取甾体化合物的技术披露。本发明通过（1）从毛蚶中提取醇溶性提取物；（2）制备毛蚶萃取物；（3）毛蚶甾体化合物提取；（4）对三个纯化合物的理化性质和波谱数据进行分析等技术步骤，对毛蚶提取物中的萃取液的正丁醇相进行分离纯化，得到了胆甾醇、胆甾烷醇和孕甾酮，测定三个甾体化合物，均对杀灭卤虫有良好的活性，在浓度为50μg/ml时对卤虫的致死率分别为65.0%、58.3%、和60%，并且随着浓度的升高杀虫率也升高，表现出浓度依赖性，本发明的应用可以大大缩短新药创制的周期，对新药的研发具有重要意义。

主权项

1.从毛蚶中提取甾体化合物的方法，其特征是所述方法的主要技术步骤是：（1）从毛蚶中提取醇溶性提取物：取鲜毛蚶洗净、去壳、取肉，于组织捣碎机中匀浆，于毛蚶浆中加入毛蚶浆体积1-2倍的90-95%的乙醇，在室温或4℃状态下，采用超声提取、微波提取、冷浸、渗漉、高压提取或回流提取的方式，提取1-4次，每次2-24小时，收集合并提取液，过滤，滤液用100–300hPa大气压减压浓缩至40℃热时测相对密度是1.2-1.3，得到毛蚶浸膏备用；（2）制备毛蚶萃取物：于毛蚶浸膏中以1：6.8-7.2的重量比加入水并充分混悬，然后分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到三种萃取液，三种萃取液分别经100–300hPa大气压减压浓缩至40℃热测时相对密度是1.2-1.3，分别得到石油醚相，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相备用；（3）毛蚶甾体化合物提取：将正丁醇相用甲醇以1：1的体积比溶解，先用Sephadax LH-20凝胶柱层析，氯仿/甲醇1︰1洗脱，点板合并馏分，然后经40℃、100–300hPa大气压减压浓缩至干，将凝胶显红色馏分用2-3ml甲醇溶解，然后再用RP-18反相硅胶柱层析，经甲醇水30%、50%、70%、90%和100%梯度洗脱，最后用高效液相，90%甲醇水洗脱，得到3个纯化合物；（4）对三个纯化合物的理化性质和波谱数据进行分析：化合物的物理常数和波谱数据为：化合物(1):无色针状结晶;¹H NMR(CDCl₃,600MHz):5.35(1H,d,J=5.5Hz,H-6),3.52(1H,m,H-3),1.00(3H,s,H-19),0.95(3H,d,J=6.5Hz,H-21),0.87(3H,d,J=6.5Hz,H-27),0.86(3H,d,J=6.5Hz,H-26),0.68(3H,s,H-18);¹³C NMR(CD₃COCD₃,150MHz):38.2(CH₂,C-1),32.4(CH₂,C-2),71.6(CH,C-3),43.3(CH₂,C-4),142.3(C,C-5),121.5(CH,C-6),32.5(CH₂,C-7),32.5(CH,C-8),51.8(CH,C-9),37.2(C,C-10),21.3(CH₂,C-11),40.5(CH₂,C-12),43.3(C,C-13),57.0(CH,C-14),24.9(CH₂,C-15),28.9(CH₂,C-16),57.6(CH,C-17),12.2(CH₃,C-18),19.8(CH₃,C-19),36.6(CH,C-20),19.1(CH₃,C-21),36.2(CH₂,C-22),24.5(CH₂,C-23),40.2(CH₂,C-24),28.6(CH,C-25),23.0(CH₃,C-26),22.8(CH₃,C-27);ESI-MS m/z387[M+H]⁺；经与标准品对照确定为胆甾醇；化合物(2):白色无定型粉末，经与标准品TLC对照得以确定为胆甾烷醇；化合物(3):白色无定型粉末;¹H NMR(CDCl₃,600MHz):5.79(1H,m,H-20),4.97(1H,s,H-21),4.96(1H,m,H-21),1.02(3H,s,H-19),0.61(3H,s,H-18);ESI-MS m/z301[M+H]⁺；经与标准品对照确定为孕甾酮；三者结构式如下所示：