[发明专利]一种高含腐殖质的河口底泥总DNA提取方法

摘要

本发明公开了一种高含腐殖质河口底泥总DNA的提取方法。用无菌生理盐水洗涤底泥，去除部分腐殖质等杂质，同时对微生物起浓缩作用；再利用CTAB、蛋白酶K和溶菌酶在液氮和65℃水浴中反复冻融，使细胞破壁，然后加SDS在65℃水浴中保温2h，以结合蛋白质；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，去除蛋白质；加等体积异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀，晾干后，用TE(pH8.0)溶解DNA；加3倍体积的无水乙醇重新沉淀DNA，70％乙醇洗涤沉淀，晾干后，用TE溶解沉淀DNA，储存在-20℃下备用。本发明的方法操作简单、价格便宜；用本发明的方法提取的河口底泥总DNA具有纯度高和生物多样性完整的优点，可以用于分子生物学研究和微生物多样性分析。

主权项

一种从高含腐殖质的河口底泥中提取总DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)底泥样品的预处理：①称取10g河口底泥放入50ml离心管中，加入30ml生理盐水，涡旋振荡5min，静置2min，在4℃下先2500r/min低速离心3min，再10000r/min高速离心8min，弃上清，取沉淀的上部1/2转移到另一新的离心管中；②重复上步2次，将得到1.25g底泥转移到10ml离心管中；③用生理盐水洗涤底泥，在4℃下10000r/min离心8min，洗涤次数直到离心后的上清为无色透明为止；(2)底泥微生物的细胞裂解：①1.25g经过预处理的底泥加2.5mL CTAB溶液，涡旋充分混匀；②在液氮和65℃水浴中反复冻融3次；③在37℃下摇30min；(3)DNA的分离：①加10％的SDS到终浓度2％，65℃水浴保温2h，每隔15‑20min颠倒混匀一次；②室温12000r/min离心10min，收集上清；③上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀；室温12000r/min离心10min，留上清；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次；④上清加等体积的异丙醇，沉淀1‑2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清；⑤用70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀；70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀3次，自然干燥；⑥用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到河口底泥总DNA粗提液；(4)DNA的纯化：①步骤(3)中DNA粗提液加3倍体积的冰冻无水乙醇，在‑20℃下沉淀1‑2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，留沉淀；②沉淀用70％的冰冻乙醇洗涤2次，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀，自然干燥；③用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最终河口底泥总DNA；DNA跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳；(5)16S rDNA的PCR：以步骤(4)提取的DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物63F(5′‑CAGGCCTAACACATGCAAGTC‑3′)和1387R(5′‑GGGCGGWGTGTACAAGGC‑3′)进行PCR，PCR产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳。