[发明专利]一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法

摘要

本发明公开了一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法，属于植物生物工程范畴，该方法内容包含配制培养基、培养基的灭菌、挑选植株和花蕾、鉴定小孢子发育时期、前处理、消毒花蕾、剥取、接种和培养花药、小孢子自然游离和逐步发育形成胚状体等步骤，获得的小孢子胚状体能正常生长，成苗数量大。本方法从培养最初到形成胚状体一般需要7～８周时间；可以获得单倍体或双单倍体。双单倍体是公认的、良好的育种材料，可用于芦笋新品种的选育和芦笋品种改良；若在育种实践中应用，应该能显著地缩短育种周期，大大地提高选择效率，从而节省大量人工、物力，是一项加速芦笋育种纯系选育较有效的方法。

主权项

一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）配制培养液和固体培养基：两种培养基所用的基本培养基均为MS，所用的碳源为蔗糖；固体培养基添加的凝固剂为琼脂，其质量浓度为0.7%～0.8%；配制培养液即在MS中，添加60～70g﹒L‑1的蔗糖，0.4～0.8 mg﹒L‑1的6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5～1.0 mg﹒L‑1的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1～1.0 mg﹒L‑1萘乙酸NAA，0.03～0.05 mg﹒L‑1谷胱甘肽L‑GLU，pH5.8；固体培养基的组成成分为：在MS培养基中，加入7～8g﹒L‑1的琼脂和30～40 g﹒L‑1的蔗糖， pH5.8； （2）培养基的灭菌和分装：固体培养基于121 ℃，1.1 MPa条件下灭菌20分钟，培养液用塑料滤器过滤灭菌，其内装有0.22微米的微孔滤膜，从而保证培养液的无菌状态；之后进行分装，灭菌后未凝固前每一培养皿先注入固体培养基10 mL，等固体培养基凝固后，每一培养皿加入培养液5 mL；（3）优选植株和花蕾：全面比较，优先选择具有综合优良性状的杂交一代芦笋品种作为试验材料；在开花初期或盛花期于上午8点前，从生长健壮的芦笋雄株上选取花蕾，从花蕾中剥出花药，轻轻放于载玻片中间，同时取几滴蒸馏水浸没花药，用镊子轻压花药，从而游离出小孢子，最后去除掉其余残留的花药组织，盖上盖玻片，置于显微镜下观察，依据观察结果，选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾用于游离小孢子培养；或用醋酸洋红压片镜检法选择花蕾，其发育处于单核靠边期时，外观相应的形态特征为饱满黄绿色；此时应定期施肥，同时摘除已过发育期的花蕾，让植株及花蕾的生长状态处于最佳；（4）花蕾前处理：阴天或晴天早上8点前，选取单核靠边期的花蕾，用培养皿或自封塑料袋盛装，马上密封好后置于4 ℃低温培养箱处理1～9 d；（5）花蕾消毒：先用有效浓度为75%的酒精表面消毒30s，再用有效氯为1%的次氯酸钠灭菌10～12min，最后用无菌水冲洗４次，第1次1min，第2次2min，第3次和第4次各3min；（6）剥取花药：剥取花药时，应小心操作，避免损伤、镊坏花药，同时应将花丝彻底去除干净；（7）接种花药：将50枚花药接入一培养皿中，用石蜡膜封口；（8）培养花药：培养皿放于32 ℃的培养箱内，暗培养2d后，再转入25 ℃培养箱内，继续暗培养，同时进行振荡以增加空气，直至长出胚状体；（9）小孢子的自然游离诱导胚状体：在该培养系统下，花药漂浮在培养液的上面，经过3～4周，小孢子从花药开裂处自然释放出来，正常进入培养液中；（10）进一步发育获得胚状体：小孢子培养5周后，开始发育形成球型胚或心型胚，培养8周后，则开始形成鱼雷型胚或子叶型胚，培养至9～11周时，清晰可见子叶型胚，将子叶型胚转接至胚萌发培养基上，能发育形成正常完整植株。