[发明专利]人外周血中造血干细胞的分离方法

摘要

本发明公开了分离富集外周血中造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）的方法，更好地为造血干细胞进行后续研究提供基础，涉及生物医学领域。方法包括树状超支聚合物与鼠抗人造血干细胞单克隆抗体共价偶联、鼠抗人造血干细胞单克隆抗体修饰的树状超支聚合物再包被长链生物素分子、鼠抗人造血干细胞单克隆抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物捕获外周血样品中的造血干细胞、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联外周血中长链生物素化树状超支聚合物、被捕获造血干细胞的分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方法相比，该方法更适用于在复杂外周血样品中对造血干细胞进行磁分离，提高了外周血样品中造血干细胞分离效率。

主权项

人外周血中造血干细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取1.0 mg树状超支聚合物，悬浮于4 mL 0.01 mol/L pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；滴加1mL 2.7 mg/mL鼠抗人造血干细胞单克隆抗体溶液，使其终浓度达到3 mg/mL左右，摇床150 r/min的转速下室温反应24 h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得树状超支聚合物‑抗体复合物；（2）取27.6 mg长链生物素，悬浮于4 mL 0.01 mol/L pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；加入1.0 mg树状超支聚合物‑抗体复合物，在摇床150 r/min的转速下室温反应24 h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素‑树状超支聚合物‑抗体复合物；（3）每取1 mL正常人新鲜外周血，加入0.2 mg抗体和长链生物素共修饰的树状超支聚合物即步骤（2）长链生物素‑树状超支聚合物‑抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min，加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；（4）磁力分离后，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有造血干细胞的纳米磁珠‑链霉亲和素‑长链生物素‑树状超支聚合物‑抗体‑造血干细胞复合物。