[发明专利]中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒

摘要

本发明公开中华鳖四个种群种质鉴定PCR检测法、引物组和试剂盒。该引物组为SEQNo.1/SEQNo.4、SEQNo.2/SEQNo.5和SEQNo.3/SEQNo.6。该试剂盒包括2×TaqPCR预混液、5U/µl酶BglI及10×酶切缓冲液A、5U/µl酶HpaII及10×酶切缓冲液B、5U/µl酶ClaI及10×酶切缓冲液C、10mg/mlBSA、对照DNA模板、10pM扩增引物。该方法用引物组对提取到的DNA进行PCR扩增，然后酶切得到酶切产物，最后进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳结果与标准电泳图谱比对得出结果。该检测方法简单、反应稳定性、重复性好，且节约成本。

主权项

1.中华鳖四个种群的种质鉴定PCR检测方法，其特性在于该方法包括以下步骤：步骤(1).总DNA的提取：按照常规方法提取待测样品的DNA，然后将提取到的DNA稀释至50～150ng/μl，保存于-20℃；步骤(2).PCR扩增：以步骤(1)提取到的DNA为模板，分别用3对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4、SEQ No.2/SEQ No.5和SEQ No.3/SEQ No.6进行PCR扩增，同时也对已知的中华鳖太湖种群、台湾种群、黄河种群和中华鳖日本品系新品种对照DNA模板进行PCR扩增；所述的PCR扩增反应体系为50ul由25μl 的2×Taq PCR 预混液、1μl上游引物、1μl对应的下游引物、1μl模板和余量的ddH₂O组成；所述的2×Taq PCR 预混液为0.1U/μl Taq酶、500uM dNTP、2×PCR缓冲液的混合液；所述的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸1min，反应进行35个循环，最后72℃延伸10min；步骤(3).酶切反应：对扩增引物SEQ No.1 / SEQ No.4的扩增产物进行Bgl I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液A；对扩增引物SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物进行Hpa II酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液B；对扩增引物SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物进行Cla I酶切，所用的酶切缓冲液为10×酶切缓冲液C；所述的酶切反应体系为25μl由15μl步骤(2)某一扩增引物或对照DNA模板扩增得到的扩增产物、2.5μl 10×酶切缓冲液、0.25μl BSA、5U限制性内切酶和余量的ddH₂O组成；所述的酶切反应条件为酶切反应体系在37℃下孵育4小时以上；所述10×酶切缓冲液A为1M、500mM、100mM 、10mM 的混合液，pH值为7.9；所述10×酶切缓冲液B为100mM、100mM、10mM的混合液，pH值为7.0；所述10×酶切缓冲液C为500mM、200mM、100mM、10mM的混合液；步骤(4).标准电泳图谱的建立：将对照DNA模板扩增得到的扩增产物的酶切产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，构建每种中华鳖的标准PCR-RFLP图谱；步骤(5).待测样品的种质来源鉴定：将待测样品的三种扩增引物扩增得到的扩增产物的酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，引物对SEQ No.1/SEQ No.4的扩增产物经Bgl I酶切后，在黄河种群中出现长度为1450bp的一条带，而其他种群中出现618bp和832bp的两条带；引物对SEQ No.2/SEQ No.5的扩增产物经Hpa II酶切后，在黄河种群和台湾种群中出现长度为715bp的一条带，在日本品系新品种和太湖种群中出现330bp和385bp的两条带；SEQ No.3/SEQ No.6的扩增产物经Cla I酶切后，在日本品系新品种中出现长度为980的一条带，在其他种群中出现长度为481bp和499bp的两条带；将电泳结果与标准电泳图谱进行比对，得出结果。