[发明专利]一种制备Ⅰ/Ⅱ胶原双层复合胶原膜的方法

摘要

本发明涉及一种I/II型双层复合胶原膜的制备方法，以及利用该方法制备的I/II型双层复合胶原膜。第一步：提取I型胶原蛋白，制备I型胶原膜；第二步：提取II型胶原蛋白，制备II型胶原膜；第三步：将I型胶原膜作为底层，II型胶原膜作为顶层，通过交联形成I/II型双层复合胶原膜。本发明的I/II型双层复合胶原膜为软骨细胞提供良好的生长环境，具有良好的软骨修复效果。

主权项

一种制备I/II胶原双层复合胶原膜的方法，包括：(一)I型胶原膜的制备：(1)将牛跟腱用超纯水清洗3次，修剪去除杂质，清洗，95％的乙醇浸泡组织10min，超纯水清洗5次；(2)将步骤(1)的牛跟腱用组织剪捣碎，浸泡在0.05mol/L乙酸中10min；(3)牛跟腱在乙酸中溶胀，成透明果冻状，匀浆，4℃操作；(4)将步骤(3)的牛跟腱放入烧杯中，加入0.05mol/L乙酸和胃蛋白酶，4℃搅拌72h进行酶解；(5)将步骤(4)的酶解液于15000r/m，30min离心，收集上清液，调整pH值至中性，4℃操作；(6)将步骤(5)的溶液于12000r/m，30min离心，收集沉淀的胶原，超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h，然后冻干形成I型胶原，4℃冷藏备用；(7)称取步骤(6)的I型胶原，溶于0.05mol/L乙酸，4℃搅拌24h，过滤胶原溶液，放入4℃医用冰箱静止24h，等待大量气泡挥发；(8)将I型胶原溶液倒入培养皿中，放入超净台中脱水，形成I型胶原膜；(二)II型胶原膜的制备：(1)超净台中用手术刀剔取猪膝关节中透明的关节软骨，超纯水冲洗5次，95％的乙醇浸泡组织脱脂10min，超纯水冲洗5次；(2)称取步骤(1)的关节软骨，粉碎组织放入10倍体积4M的盐酸胍(pH7.5)，搅拌24h，4℃操作；(3)将步骤(2)的溶液搅拌过滤，留取滤液，15000r/m，30min离心，留取上清液，NaOH调整pH值至中性，4℃操作；(4)将步骤(3)的上清液于12000r/m，30min离心，收集沉淀组织，用超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h；(5)向透析后的沉淀组织加入10倍体积的0.05mol/L乙酸和胃蛋白酶进行酶解，4℃搅拌72h；(6)将步骤(5)的溶液过滤，收集滤液，15000r/m，30min离心，留取上清液用NaOH溶液调整pH值至中性，4℃静置24h；(7)将步骤(6)的上清液于12000r/m，30min离心，收集胶原沉淀，用超纯水透析，4h更换一次超纯水，透析36h，冻干形成II型胶原，干燥4℃冷藏备用；(8)称取制备好的II型胶原膜1000mg，溶于0.05mol/L乙酸，4℃搅拌24h，待胶原溶液完 全溶解后，用100目滤网过滤胶原溶液；(9)用NaOH溶液调整胶原溶液pH值至中性，13000r/m，10min离心，倒出上清液继续低温高速离心，14000r/m，10min，然后倒出上清液，继续低温高速离心，15000r/m，10min，收集三次离心的上清液，计算II型胶原浓度，取出胶原沉淀平铺在培养皿中，冻干形成II型胶原膜，干燥4℃冷藏备用；(三)I/II型双层复合胶原膜的制备：(1)将上述制备的II型胶原膜平铺在培养皿中的I型胶原膜上，厚度约为2mm，放入冰箱‑20℃预冻4h，一80℃再次冷冻24h，冻干机冻干；(2)将0.05mol/L MES、0.033mol/L EDC和0.02mol/L NHS溶于95％乙醇溶液，配制交联剂，用交联剂浸泡I/II型双层复合胶原膜，放入立式恒温振荡器于室温下交联24h；(3)取出步骤(2)的胶原膜，室温下继续交联24h，超纯水冲洗；(4)‑20℃预冻4h，‑80℃再次冷冻24h，冻干机冻干，形成I/II型双层复合胶原膜。