[发明专利]含猪圆环病毒2型细胞的培养方法

摘要

本发明涉及含猪圆环病毒2型细胞的培养方法，该方法包括单个含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆及其亚群的培养：将PCV2/SN07-12种毒接种于无1型猪圆环病毒污染的猪肾细胞(PK15细胞)中，PCV2/SN07-12种毒的微生物保藏登记号为：CCTCC NO：V201304，阳性含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆株的筛选、高滴度猪圆环病毒2型的增殖三个步骤，培养得到病毒滴度达10^7.0TCID₅₀/ml。与现有技术相比，本发明培养得到的细胞具有工艺简单、病毒滴度高、生物学特性稳定等优点。

主权项

含猪圆环病毒2型细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)单个含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆及其亚群的培养将PCV2/SN07‑12种毒接种于无1型猪圆环病毒污染的猪肾细胞(PK15细胞)中并在37℃培养箱中培养，使用胰酶消化处于对数生长期的单层含猪圆环病毒2型的PK15细胞，然后采用有限稀释法，按照每孔100uL含20wt％牛血清细胞生长液，0.5个细胞/孔的密度，加入96孔细胞培养板置于含5vt％CO₂，温度为37℃培养箱中培养，挑选有单个细胞生长的细胞孔中细胞进行亚克隆培养，使用胰酶消化后，加入牛血清细胞生长液，再加入96孔细胞培养板置于含5vt％CO₂，温度为37℃培养箱中培养72h；(2)阳性含猪圆环病毒2型PK15细胞克隆株的筛选取长满单层96孔细胞培养板，弃去培养液，PBS洗涤细胞3次，经无水乙醇在‑20℃固定2h，封闭液洗涤1次，再利用封闭液在37℃作用30min，加入PCV2抗血清，37℃作用45min，PBS洗涤细胞3次后，加入荧光标记A蛋白(FITC‑SPA)，37℃作用45min，洗涤3次后加封片液(Mounting‑Fluid)，荧光显微镜下挑选荧光数量最多的克隆株为猪圆环病毒2型高感染性的PK15细胞亚群，重复克隆一次，对含猪圆环病毒2型PK15细胞株进行纯化后获得含PCV2高感染比例的PK15‑A8细胞系；(3)高滴度猪圆环病毒2型的增殖利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15‑A8细胞系并接种于细胞培养瓶内，加入含7wt％‑10wt％犊牛血清的DMEM营养液，在37℃培养24h，弃生长液，加入含2wt％犊牛血清的DMEM维持液，于37℃培养72‑96h，收获细胞培养物，冻融3次，既得到高滴度猪圆环病毒2型。