[发明专利]猪α-干扰素复合制剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪α-干扰素复合制剂的制备方法，它的步骤如下：（1）人工合成150bp的短小乳酸杆菌信号肽序列，构建出pUCK-SP载体；（2）构建出pUCK-SP-IFN-α质粒，pUCK-SP-IFN-α质粒经NdeⅠ和EcoRI酶切，回收SP-IFN-α片段；（3）构建干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8-plac-SP-IFN-α；（4）通过电转化方法，得到猪α-干扰素复合制剂；本发明拟将猪IFN-α基因导入干酪乳酸杆菌中，从而获得能表达猪IFN-α的干酪乳酸杆菌。这样的菌株集抗病毒、抗菌作用于一身，且可通过口服途径饲喂动物，十分方便。

主权项

一种猪α‑干扰素复合制剂的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：（1）人工合成150bp的短小乳酸杆菌信号肽序列，包括SP上游的酶切位点NdeⅠ及下游的酶切位点，下游的酶切位点依次为KpnⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、Pst I、SphⅠ、Hind Ⅲ和EcoR I，并克隆到PUCK载体，构建出pUCK‑SP载体；（2）通过PCR方法从 pMD18‑IFN‑α载体上扩增出501bp的猪IFN‑α基因序列，并插入pUCK‑SP载体的KpnⅠ和EcoR I酶切位点，构建出pUCK‑SP‑IFN‑α质粒，pUCK‑SP‑IFN‑α质粒经NdeⅠ和EcoR I酶切，回收SP‑IFN‑α片段；（3）根据Genbank发表的干酪乳酸杆菌乳糖操纵子基因序列，设计1对特异引物，上游引物5’端加入PstⅠ酶切位点，下游引物5’端依次加入KpnⅠ、NdeⅠ酶切位点，利用PCR方法从干酪乳酸杆菌基因组DNA中扩增出298 bp乳糖启动子plac序列，利用T4DNA连接酶把乳糖启动子片段和SP‑IFN‑α片段连接，然后使用乳糖启动子上游引物和猪IFN‑α下游引物通过PCR扩增串联出plac‑SP‑IFN‑α片段，将plac‑SP‑IFN‑α片段连接到穿梭载体pIAbeta8，转化DH5α感受态细胞，构建干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8‑plac‑SP‑IFN‑α；（4）通过电转化方法，把干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8‑plac‑SP‑IFN‑α转进干酪乳酸杆菌感受态细胞，在氯霉素固体培养基上培养48小时，筛选出阳性菌株，然后，用溶菌酶破壁方法提取阳性菌株质粒，得到猪α‑干扰素复合制剂。