[发明专利]一种双组份植物激素的同时测定方法

摘要

本发明涉及一种双组份植物激素的同时测定方法，用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体，以ABEI-BSA@AuNPs为纳米粒子标记物，实现对两种植物激素的捕获，并以抗体标记的ABEI-BSA@AuNPs纳米粒子为化学发光探针，再用磁性分离和离心方法实现所捕获激素的分离，然后测定磁性分离液和离心分离液的化学发光信号，从而实现了两种植物激素的检测。本发明仅需磁珠、纳米粒子和简单的化学发光技术就实现了植物激素IAA与GA的同时测定，方法简单、成本低、灵敏度高的优势。

主权项

一种双组份植物激素同时测定的方法，植物激素为IAA和GA的双组份，其特征在于用金纳米粒子和氨基化磁珠为载体，以ABEI‑BSA@AuNPs为纳米粒子标记物，实现植物激素IAA和GA的双组份同时测定，测定步骤如下：（1）金纳米粒子AuNPs的制备，制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水泡洗30 min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL质量浓度0.01%的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8 mL质量浓度1%的Na3C6H5O7，继续加热10 min，搅15 min，冷却至室温，转移到棕色瓶中于阴凉处保存；（2）anti‑IAA抗体标记金纳米粒子的制备，取2 mL的样品管，依次加入pH为8.2的2 μL 500 mM的Tris‑HCl，6 μL10 mM的TCEP，6 μL 10‑4 M的巯基乙胺，室温放置30 min后加入1 mL 步骤（1）制备的AuNPs，室温下反应12 h，得巯基乙胺修饰金纳米粒子；取上述所得的巯基乙胺修饰金纳米粒子分散在含5（wt）%戊二醛的磷酸缓冲溶液中，持续搅拌2 h，用磷酸缓冲溶液离心清洗3次，再将其在磷酸缓冲溶液中，加入含10 μg anti‑IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到anti‑IAA抗体标记金纳米粒子；（3）anti‑GA抗体标记磁珠的制备，在2 mL的样品管中加入含10 μg anti‑GA抗体溶液，再加入1000 μL 含0.1 M的EDC和0.2 M的NHS，活化30 min，另取一个10 mL的小烧杯，加入50 μL粒径为2～3 μm氨基化磁珠，2000 μL 0.1M，pH为6.8咪唑缓冲液，活化30 min；将上述两溶液混合反应12 h，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，用磷酸缓冲溶液定容至500 μL，得到anti‑GA抗体标记磁珠；（4）抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs的制备a. BSA@AuNPs纳米粒子的制备，将5 mL经过恒温的HAuCl4溶液加入到5 mL浓度为 50 mg/mL的BSA溶液中，搅拌反应2 min，然后加入0.5 mL 1 M NaOH，并在37 ℃下继续反应1小时，得BSA@AuNPs纳米粒子，粒径为2‑3 nm，室温下保存；b. ABEI‑BSA@AuNPs的制备，在pH为7.4的PBS缓冲溶液加入1 mL BSA@AuNPs，再加入NHS 10 mg、EDC 20mg，将该混合液在37 ℃下搅拌1小时，然后加入1 mL N‑(4‑氨丁基)‑N‑乙基异鲁米诺溶液，在室温下搅拌12‑18小时，得到ABEI‑BSA@AuNPs复合物；c. 抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs的制备，取1 mL ABEI‑BSA@AuNPs溶液，加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg，在37 ℃下活化1小时，再加入100 μL的ABEI‑BSA@AuNPs，反应时间12‑18小时；再将其分成两份，一份加入含10 μg anti‑IAA抗体溶液，4 ℃振动孵育1 h，得到IAA抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs；另外一份10 μg anti‑GA抗体溶液，4 ℃振动孵育12 h，得到GA抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs；（5）双组分植物激素的检测，将不同量的目标物IAA和GA标准溶液分别混合，加入anti‑GA抗体标记磁珠和anti‑IAA抗体标记金纳米粒子，37 ℃孵育1 h，离心分离，离心机转速为14000 rpm，分离后用PBST溶液清洗3次，再加入GA抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs和IAA抗体标记ABEI‑BSA@AuNPs混合溶液，37 ℃孵育1 h；随后，用包含有2% BSA的WB洗涤液洗涤3次，分成2等份，一份在磁性分离器下吸弃上清液，下层溶液用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对GA进行定量；另外一份，在磁性分离器下吸取上清液，将所得上清液在13000 rpm转速下离心，收集沉淀，并用磷酸缓冲溶液洗涤3次，然后进行化学发光测定，根据化学发光信号对IAA进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；（6）样品分析，将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（5）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（5）所得标准曲线可以获取植物激素IAA和GA含量。