[发明专利]植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用，用于构建dsRNA植物表达载体，dsRNA序列与番茄花叶病毒的起始组装序列相连，因此转录的RNA分子能够被ToMV的外壳蛋白（CP）所包装；所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框架，其编码的CP能包装含OAS的RNA分子，dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下，使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。本发明载体中，dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累，其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳虫等。

主权项

一种蚜虫基因dsRNA植物表达载体pRNAiAV2，其特征在于：所述载体的构建方式如下：(1)以ToMV基因组为模板，利用引物CP_F和CP_R扩增得到CP基因片段；(2)BamHI/PstI双酶切将Rol启动子从pUC57载体上切下，克隆到p221CP的BamHI/PstI的位点，得到载体p221‑Rol‑CP；(3)以载体pBI221为模板，利用引物NOS_F/NOS_R扩增得到NOS终止子，将NOS终止子通过限制性内切酶HindIII/PstI位点克隆到p221‑Rol‑CP，构建为载体p221‑RolCPNOS；(4)以ToMV基因组为模板，利用引物OAS_F和OAS_R扩增得到OAS基因片段，将OAS基因片段通过限制性内切酶BspEI/PstI位点克隆到p221‑RolCPNOS，构建为载体p221RolCPOAS；(5)将p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相应位点，构建成表达载体pBiRolCPOAS；(6)以棉蚜AV2基因片段为模板，用引物AV2_F和AV2_R扩增棉蚜AV2的部分片段，将扩增得到的片段克隆到pGEM‑T easy载体，用XmaI和XbaI从载体上把AV2片段切下，命名为AV2_XX；(7)用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS，回收载体片段，并与AV2_XX连接，构建得到载体pRolAV；(8)用BspEII和AvrII消化pRolAV，回收载体片段，并与AV2_XX连接，构建得到载体pRNAiAV2；其中所述的Rol启动子的序列如SEQ ID NO.2所示，所述的棉蚜AV2基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物CP_F为：GGATCCACCATGTCTTACTCAATCACT，CP_R为GAGCTCTTAAGATGCAGGTGCAGA，NOS_F为CTGCAGTCCGGATCGTTCAAACATTTGG,NOS_R为AAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGA，OAS_F为CTGCAGCCCGGGTCTAGAATTTGTGTCTGTGTGTATTG，OAS_R为TCCGGACCTAGGGTCAGCCCATACAGA。