[发明专利]一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法

摘要

本发明公开了一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其步骤包括：一、产硫酸软骨素酶的微生物初筛；二、产硫酸软骨素酶的微生物复筛；三、菌种鉴定；四、产硫酸软骨素酶的微生物发酵；五、发酵后硫酸软骨素酶提取。本发明操作方便、周期短，发酵产生的硫酸软骨素酶活力高达3981U/L，可用于大规模工业化生产，解决了目前由于硫酸软骨素酶产量低，价格昂贵，严重制约小分子硫酸软骨素行业发展的问题。

主权项

一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法，其特征在于，步骤包括：一、产硫酸软骨素酶的微生物初筛：用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10‑5，取稀释液0.2ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化1～2次，得到纯菌落，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，30℃温箱中培养4‑7天后，向平板中倒入5ml 2mol/L的冰醋酸，浸泡5min，观察透明圈的有无，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用；二、产硫酸软骨素酶的微生物复筛：将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，30℃，130r/min振荡通气培养48h，将菌液梯度稀释至10‑9，取0.2ml 10‑7、10‑8、10‑9的菌液，涂布于初筛培养基中，并使每个平板中培养基的厚度相同，30℃温箱中培养4‑7天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，30℃、130r/min振荡通气培养24h，经平板菌落计数得菌体密度为2×107～3×107个/ml作为种子菌液，用于菌种鉴定和发酵培养；三、菌种鉴定：运用形态特征鉴定和16SrDNA扩增与比对方法对步骤二得到的微生物菌种进行鉴定；四、产硫酸软骨素酶的微生物发酵：按1.5‑2.5% v/v接种量将种子菌液接入5L发酵罐中通过发酵培养基发酵，25‑30℃，发酵60‑72h；五、发酵后硫酸软骨素酶提取：将步骤四所得发酵液置于离心机中，4℃、4000r/min离心30min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置24h,然后4℃、4000r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中利用三蒸水对蛋白沉淀透析脱盐，在(NH4)2SO4溶液检测透析袋外液体不含SO42‑的情况下，将透析液冷冻干燥即得硫酸软骨素酶粉。