[发明专利]表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVHSTF及用途

摘要

本发明公开了一种表达铁纳米颗粒和温度敏感通道的病毒AAVHSTF及用途，该病毒包括AAVHSTF1和AAVHSTF2两种病毒，这两种病毒通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计，然后进行病毒AAVHSTF的包装；AAVHSTF1和AAVHSTF2两种病毒分别具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的基因序列。本发明的表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVHSTF不需要植入电极或光纤，无动物组织损伤性；组织穿透性强，可进行全脑范围内弥散性的刺激；时间、空间精确性高；能够在清醒自由运动中的动物中进行实时控制；细胞特异性高；因此在脑功能的研究和临床神经精神疾病的治疗中具有更高的应用价值。

主权项

一种表达铁纳米颗粒以及温度敏感通道的病毒AAVHSTF，其特征在于，其特征在于，它包括表达温度敏感通道的病毒AAVHSTF1和表达铁纳米颗粒的病毒AAVHSTF2，其中，所述病毒AAVHSTF1通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计：带有his‑tag的TRPV1构建在CMV启动子下游，mCherry报告基因克隆于TRPV1下游，在TRPV1和mCherry之间有一个2A自身裂解片段，从而实现铁融合蛋白和EGFP的非融合共表达；然后进行病毒AAVHSTF1的包装：腺相关病毒经过表达、包装和包埋带有目的片段的质粒后，转染到HEK293T细胞系中，使其充分表达并形成病毒颗粒；48小时后将培养基收集，用多步离心法进行病毒颗粒的纯化和浓缩，最后将病毒溶解在灭菌的PBS中，分装并储存于‑80℃备用，从而得到病毒AAVHSTF1；该病毒AAVHSTF1具有SEQ ID NO.1所示的基因序列；所述病毒AAVHSTF2通过以下方法制备得到：首先进行目的片段构建设计：小鼠铁蛋白重链与小鼠铁蛋白轻链之间用一个可变链接区进行克隆，形成铁蛋白轻链‑连接体‑重链融合蛋白，EGFP报告基因克隆位于铁蛋白融合蛋白基因下游，在铁融合蛋白和EGFP之间有一个2A自身裂解片段，从而实现铁融合蛋白和EGFP的非融合共表达；为了实现在某一类型的神经元的基因特异性表达，我们在CMV启动子下游TRPV1、铁融合蛋白之前插入了一段floxed stop 序列；然后进行病毒AAVHSTF2的包装：腺相关病毒经过表达、包装和包埋带有目的片段的质粒后，转染到HEK293T细胞系中，使其充分表达并形成病毒颗粒；48小时后将培养基收集，用多步离心法进行病毒颗粒的纯化和浓缩，最后将病毒溶解在灭菌的PBS中，分装并储存于‑80℃备用，从而得到病毒AAVHSTF2；该病毒AAVHSTF2具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。