[发明专利]一种头孢菌素C高产菌株选育方法

摘要

本发明公开了一种头孢菌素C高产菌株选育方法，涉及微生物菌株选育领域，本发明采用代谢调控育种的方法，克服了菌株对诱变剂的饱和效应，有利于突变菌株的产生；且采用半连续发酵的方法，使优良性状的菌株快速建立生长优势，增大了筛选到优良菌株的机率；本发明的菌株选育方法简便、快速、高效。

主权项

一种头孢菌素C高产菌株选育方法，包括以下步骤：1)取‑80℃顶头孢霉冷冻菌丝，20～40℃快速解冻，以1～6.7％的接种量接种到种子培养基中，摇床振荡培养2～6天；2)以1～33.3％的接种量接种到发酵培养基中，摇床振荡培养4～10天；3)再以1～33.3％的接种量接种到发酵培养基中，摇床振荡培养4～10天，此过程重复7次；4)从摇床上取下摇瓶，用生理盐水进行10倍系列梯度稀释，用红血球计数板计数，找到顶头孢霉节孢子数量在106～108的稀释度10‑4；(我们做过多次试验，在10‑4这个稀释度时节孢子量为106～108，这个数据清楚确定。)5)以步骤4的稀释度为中心，选取5个梯度(10‑2，10‑3，10‑4，10‑5，10‑6)菌悬液均匀涂布脂肪酶鉴定平板，每个梯度设置3个重复，将平板置于20～30℃温度下静置培养10～20天；6)培养结束后将培养好的平板置于350nm紫外灯下，用牙签挑取荧光圈大小适中并且边界清晰的菌落，接种到正常平板上，于20～30℃温度下静置培养10～20天，制备1～2cm×4～6cm的菌苔；7)将预先制备的头孢菌素C敏感菌平板培养基融化，待温度降至45℃左右时向其中接入终浓度为108CFU/mL左右敏感菌，倾倒平板，凝固后备用；8)用直径为5mm的打孔器在步骤6制备的菌苔上打孔，制备琼脂柱，用接种环挑取此琼脂柱接种到步骤7的平板上，置于30～40℃的温度下静置培养1～2天；9)培养结束后，用游标卡尺量取抑菌圈直径，挑选直径大于35mm的菌株进行另一轮的平板复筛试验；10)经过多轮次的平板复筛后，筛选出10个抑菌圈较大的菌株制备冷冻菌丝，按照步骤1和步骤2的方法进行摇瓶复筛，测出发酵培养结束后发酵液中头孢菌素C的含量，进行多次斜面传代、多批次的菌株遗传稳定性和生产 性能试验，筛选出发酵水平最高的菌株1～2株。