[发明专利]一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及医学生物检测技术领域。本发明提供了一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒，首先用环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测出是否为黄病毒阳性，然后，在阳性的基础上，可同时检测和区分出乙型脑炎的病原体（JEV）、登革病原体(DEV)及西尼罗病原体(WNV)。本发明还提供了利用上述快速联合检测三种黄病毒的试剂盒进行检测的方法。本发明的试剂盒检测简便、快速、灵敏，可实现三种黄病毒的联合快速检测。

主权项

一种快速联合检测三种黄病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是利用环介导等温扩增技术同时检测乙型脑炎的病原体、登革病原体及西尼罗病原体，该试剂盒包括主反应液A和特异引物P：(Ⅰ)主反应液A：含有10倍等温反应缓冲液、浓度为5U/μl的禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶、浓度为40U/μl的核酸酶抑制剂、浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶、浓度为10mM的dNTP、浓度为100mM的硫酸镁、和浓度为5M的酣菜碱；所述的10倍等温反应缓冲液，含有浓度为200mM、pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、浓度为100mM的氯化钾、浓度为100mM硫酸按、浓度为20mM的硫酸镁和浓度为1％的曲拉通X‑100；（Ⅱ）特异引物P：由黄病毒科病毒引物PFV、乙脑病毒引物PJEV、登革病毒Ⅰ型引物PDV1、登革病毒Ⅱ型引物PDV2、登革病毒Ⅲ型引物PDV3、登革病毒Ⅳ型引物PDV4、西尼罗病毒引物PWNV组成；每种引物各包括20μM内引物FIP,20μM内引物BIP，10μM外引物F3，10μM外引物B3,20μM环引物FLP，20μM环引物BLP；各引物序列如下：ⅰ)黄病毒科病毒引物PFV序列如下：PFVF3  AAGCTACGAAGTGAAAGCCAPFVB3  ACATCCATCTTGCCACGATGPFVFIP CCACGTTTTGCAAGGTGTCCCATTTTCTCAGCCAGCTCAATGGTTPFVBIP TGGGCAACAGCGCGTTTTTAAATTTTTCATGACCCTAGCTGTTCCTPFVFLP TGACAGTATCCTAACTACCCCATPFVBLP GATACTAAAGCCCCAGAACCACⅱ)乙脑病毒引物PJEV序列如下：PJEVF3  AACCAACACTAGATGTCCGCPJEVB3  TCAATGCTTCCTTTCCCGAAPJEVFIP GCATCGAGCCACCGTTGAAATGTTTTGCCAACTTGCTGAAGTCAGGPJEVBIP ACAACGAAAAACGTGCCGACAGTTTTCATCCATTTCCCCATCCGCPJEVFLP GACTGAAGCGTGATAGCAGTAACPJEVBLP CAGCTACGTGTGCAAACAAGGCⅲ)登革病毒Ⅰ型引物PDV1序列如下：PDV1F3  ACTGTTGGTGCAATGCCAPDV1B3  GCATGTGCTAGAAAGAGGGCPDV1FIP GCGACGGAACGCTTGTCTCGTTTTGGTGACCTATGGAACGTGTTPDV1BIP AGCCGAAACGTGGATGTCCTCTTTTTAATCCTGGGTGTCTCAGAGCPDV1FLP TGTAGGTCATTGTGTCCTCACAPDV1BLP GGTGACCTATGGAACGTGTTCⅳ)登革病毒Ⅱ型引物PDV2序列如下：PDV2F3  CCATGGACCTTGGTGAATPDV2B3  GTGTCTCCAGTCCCATTCPDV2FIP AGTTGCACCAACAATCTATGTCTTCTTTTTGTGAAGATACAATCACGTACAPDV2BIP ATGGGTAACTTATGGGACGTGTTTTTCCACATGTGGAACGAGTGPDV2FLP TGGTTCATTCTGCCTGAGAAGAPDV2BLP CCACCACAGGAGAACACAGAⅴ)登革病毒Ⅲ型引物PDV3序列如下：PDV3F3  CCCCACATTACCGAAGTGGPDV3B3  ACCTTCTCGACTTGTCTCCAPDV3FIP GCGTCTATGCTCTCCAGCTTGATTTTTTGACTGCTGGTGCAACCPDV3BIP AGATCAGTGGCGTTAGCTCCCCTTTTCATCCAGGTTTGAGTGCGTPDV3FLP CCATAAGTCACCCATGTCGATGTPDV3BLP GTCGGCATGGGACTGGACACⅵ)登革病毒Ⅳ型引物PDV4序列如下：PDV4F3  GGTCATGTATGGGACATGCAPDV4B3  CGCTGGATTCCTGTTTGCCPDV4FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATTTTTCTCAGAGTGGGGAACGGAPDV4BIP ATCGGAAGGGGCTTGGAAACATTTTTCCTGCCAAGAGAGCGAATPDV4FLP GTGGTGTTAGGGCTACTGAGCPDV4BLP CAGAGGGTAGAGAGTTGGATACTⅶ)西尼罗病毒引物PWNV序列如下：PWNVF3  CGAAGTGGCCATTTTTGTCCPWNVB3  ATGCATTGGTGTCAATCCCTPWNVFIP ATCTCCCTGCCTGAGTGGCTCTTTTCAACTACTGTGGAGTCGCACPWNVBIP TGCGGCGCCTTCATACACACTTTTGACCGTGGTTCACAGTCCPWNVFLP AGCCTGTGTGGAGTAGTTTCCPWNVBLP AGCTTGGAGAATATGGAGAGGTG。