[发明专利]一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法

摘要

本发明公开了一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，具体包括以下步骤：（1）家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因(Bmace1)的克隆；（2）对Bmace1进行定点突变，对产物克隆与测序验证，获得突变的Bmace1；（3）利用真核表达系统对突变的Bmace1进行表达获得对辛硫磷敏感性降低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶。该方法通过对Bmace1中3个重要位点进行突变，使其编码的氨基酸发生改变，使其翻译的蛋白对辛硫磷农药的敏感性降低了40.08%，操作简单；由此方法获得的新型家蚕1型乙酰胆碱酯酶为转基因培育抗辛硫磷农药家蚕新品种提供了素材。

主权项

一种降低家蚕1型乙酰胆碱酯酶对辛硫磷敏感性的方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）克隆家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因，具体为取经常规饲养的家蚕幼虫，提取家蚕总RNA，经DNA酶处理后，反转录制备cDNA；以家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因为目的基因设定PCR扩增引物，进行RT‑PCR扩增；将扩增产物克隆进pGEM‑T载体后获得重组质粒，对质粒DNA进行测序，选出序列正确的质粒DNA；所述PCR扩增引物为SEQ ID No.1：TTGTGGGTGTAGGTGCCAGCGACGGTAT以及SEQ ID No.2：ACTTATATGGTGTATTTGAACAGTGCTGTGCCTGTA；（2）定点突变家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因的四个核苷酸位点，具体为以步骤（1）中测序正确的质粒DNA为模板，首先以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；再以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.5、SEQ ID No.6引物进行第二次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序；最后以测序正确的质粒DNA为模板，用SEQ ID No.7、SEQ ID No.8进行第三次进行PCR扩增，对PCR产物进行克隆和测序鉴定；选取测序正确的序列即为突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因序列；所述四个核苷酸位点为907位G→T、986位G→C、1660位C→T以及1661位T→C；（3）定点突变基因的表达，具体为将步骤（2）获得的突变后的家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因去除肽信号后克隆到杆状病毒转移载体中，转化E. coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒，转染sf9细胞，对sf9细胞表达产物进行纯化即获得了对辛硫磷敏感性低的家蚕1型乙酰胆碱酯酶；所述引物SEQ ID No.3为：TTATTCGGTGAATCATCGGGAGCCGTGTCAG；SEQ ID No.4为：CTGACACGGCTCCCGATGATTCACCGAATAA；SEQ ID No.5为CTATCATGCAGTCTGCAGCCGCCACTGCTCC；SEQ ID No.6为GGAGCAGTGGCGGCTGCAGACTGCATGATAG；SEQ ID No.7为：GTTCGGGGAGCCTTCCAATCCCGGGAAA；SEQ ID No.8为：TTTCCCGGGATTGGAAGGCTCCCCGAAC。