[发明专利]一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法

摘要

本发明公开了一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生。本发明提供的橡胶树原生质体分离纯化的方法简单易行，原生质体看护培养所用的看护培养基成分大为简化，并采用橡胶树自身品种的悬浮细胞系作为看护细胞，极大降低了生产成本，而且有效提高了橡胶树原生质体分裂形成细胞克隆的频率及其后体细胞胚发生的频率。为利用原生质体融合（即体细胞杂交）和遗传转化等这些具有重大应用前景的生物技术育种方式进行橡胶树品种改良和种质创新提供良好的受体系统。

主权项

一种橡胶树原生质体培养植株再生的方法，其特征在于包括胚性细胞悬浮系的建立、原生质体的分离和纯化、原生质体的看护培养、原生质体再生细胞克隆的继代增殖、体细胞胚的诱导及植株再生，步骤如下：（1）胚性细胞悬浮系的建立：将常规方法诱导的橡胶树未成熟花药或内珠被胚性愈伤组织转入液体培养基中，置于摇床上进行悬浮培养，每周继代一次，得到稳定均质的悬浮细胞系；（2）原生质体的分离和纯化：取稳定均质后继代培养第3～7天的胚性悬浮细胞1～3g转至100ml三角瓶中，加入10～30ml溶解于原生质体洗涤液的酶混合物中进行原生质体的酶解分离。酶解后采用过滤离心法进行纯化，所得的原生质体沉淀用适量原生质体洗涤液和原生质体液体培养基漂洗，最后以适当密度悬浮于原生质体液体培养基中；（3）原生质体的看护培养：以继代保存于液体培养基中的橡胶树杂交品种H.brasiliensis×H.nitida的悬浮细胞系作为看护细胞，采用看护培养的方法进行橡胶树原生质体的培养。吸取悬浮于原生质体液体培养基中、密度调整为0.1×106～5×106个/ml的橡胶树原生质体悬液0.5～1.0ml接种至含3%～10%看护细胞的看护培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行看护培养45～60天，期间每两周更新一次看护培养基，得到肉眼可见的原生质体再生细胞克隆；（4）原生质体再生细胞克隆的继代增殖：挑取直径为2mm以上的原生质体再生细胞克隆转至继代培养基中，置于28±1℃、黑暗条件下进行增殖培养，每20天继代一次；（5）体细胞胚的诱导及植株再生：将继代增殖的原生质体再生细胞克隆转至体细胞胚诱导培养基中，于28±1℃、黑暗条件下进行体细胞胚的诱导，25～40天后开始出现白色球形胚，继续在体细胞胚诱导培养基中培养至体细胞胚发育成熟，随后将成熟的子叶形胚转至体细胞胚萌发培养基上黑暗培养，15～30天后开始抽芽长根，随后将其转至28±1℃、光照条件下继续培养，获得完整的原生质体再生植株。