[发明专利]利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法

摘要

本发明公开了利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，包括以下步骤：将外接信号肽的B-domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件，然后通过显微注射或体细胞移植技术获得转基因家兔，获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。本发明实现了第八凝血因子的乳腺表达构件在转基因家兔乳腺生物反应器表达，以制备rhFVIII，转基因家兔进行快速的种群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，实现了rhFVIII的批量生产，都在很大程度上降低了生产成本，并且避免了使用血浆中提取的hFVIII感染病毒的风险，提高了用药的安全性。

主权项

利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外接信号基因的B‑domain缺失的重组人第八凝血因子cDNA插入质粒载体中形成第八凝血因子的乳腺表达构件；(2)将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中，然后将家兔受精卵在FBS B2培养液和35℃～40℃、3％～7％CO2培养箱中培养10‑20h，之后将分裂成2～8个细胞的家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因家兔；(3)将所述乳腺表达构件通过转染至家兔供体细胞中，然后将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因家兔。(4)步骤(2)和步骤(3)获得的转基因家兔的当代或后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第八凝血因子。