[发明专利]一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，特点是包括将嗜酸乳杆菌 水浴杀菌加入TritonX-100溶液反应后离心洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体的制备步骤；将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中反应后离心，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中反应后离心，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中反应后离心得到酶解破壁的菌体步骤；将酶解破壁的菌体洗涤脱脂后加入酶溶液Ⅳ去蛋白的步骤；将去脂去蛋白沉淀透析盐析，离心取沉淀透析后，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖的步骤；将嗜酸乳杆菌肽聚糖加入四甲基哌啶和NaBr及NaClO反应处理后，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物，优点是操作简单，反应时间短，且溶解性显著增加、抗氧化活性明显提高。

主权项

一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：  （1）湿菌体的制备   将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60‑70℃水浴35‑45min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X‑100溶液，于80‑90℃水浴0.5‑1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g‑15000×g离心8‑12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g‑15000×g离心8‑12 min后弃上清，然后用甲醇‑水、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；  （2）酶解破壁将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35‑40℃水浴10‑14 h，再于4℃、10000×g‑15000×g离心30‑50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35‑40℃水浴10‑14 h，再于4℃、10000×g‑15000×g离心30‑50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35‑40℃水浴处理20min，再于4℃，10000×g‑15000×g离心30‑50min弃上清取沉淀；  （3）去脂去蛋白   将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇‑氯仿及氯仿洗涤脱脂，于10000×g‑15000×g离心35‑45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35‑40℃消化10‑15h，再于4℃，10000×g‑15000×g离心30‑50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；  （4）纯化将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5‑3.5d后，经0.01 mol/L的硫酸溶液于85‑95℃ 处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、10000×g‑15000×g离心25‑35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5‑3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；其中硫酸溶液与原料嗜酸乳杆菌的比例为2mL：3g；  （5）TEMPO‑NaClO‑NaBr选择性氧化修饰   在烧杯中加入一定量的嗜酸乳杆菌肽聚糖和适量的蒸馏水，再加入一定量的四甲基哌啶（TEMPO）和NaBr，用玻璃棒搅拌均匀，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入一定量的NaClO，控制温度为4℃，调节pH为8.4‑8.6，反应25‑35min，加入Na2SO3还原未反应的微量氧化剂，加入少量乙醇终止反应，将反应液倒于过量的乙醇中，并不断搅拌，静置一段时间，抽滤得到滤饼，将滤饼用乙醇水溶液多次反复洗涤后，透析，冷冻干燥，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物。