[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA-LFD检测方法及其检测试剂盒。本发明是根据GenBank上公布的罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）序列，筛选保守区域设计了MrNV NASBA-LFD反应体系所需的引物与探针；采用本发明人配制的组织RNA提取试剂提取待检样品RNA，再利用本发明建立的MrNV NASBA反应体系进行检测，在反应结束后依据核酸快速检测试纸判定结果。与现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，可用于生产一线的技术人员和养殖户现场使用，有利于罗氏沼虾白体病的诊断预防与病原阻断。

主权项

一种罗氏沼虾野田村病毒NASBA‑LFD检测方法，其特征在于：包括如下步骤：病毒RNA的提取：（1）取20‑30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350‑500μL裂解液匀浆，离心；（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；NASBA扩增：（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16‑21μL，包括：0.2‑0.4μmol/L引物MrNV‑P1F，0.2‑0.4μmol/L引物MrNV‑P1R， 0.1‑0.2μmol/L 探针MrNV‑FITC‑PROBE，30‑50mmol/L的 pH8.0‑8.5Tris‑HCl， 20‑50mmol/L 氯化钾， 10‑50 mmol/L 氯化镁，2‑10mmol/L 二硫苏糖醇，10%‑15% DMSO，1‑2mmol/L dNTP，2‑4mmol/L NTP，0.1‑0.2μg/μL BSA，10‑20U RNase 抑制剂，2‑6U逆转录酶AMV，20‑40U  T7 RNA 聚合酶，0.1‑0.3U RNaseH；引物MrNV‑P1F序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV‑P1R序列见SEQ ID NO：2，探针MrNV‑FITC‑PROBE序列见SEQ ID NO：3；（6）在16‑21μL预反应液中加入4‑9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20‑25μL，然后在40℃‑42℃下反应60‑120min；LFD试纸检测：（7）取步骤（6）所得NASBA扩增产物5‑10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50‑100μL缓冲液，5‑15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。