[发明专利]分泌表达外源蛋白的酵母转化子及其制备方法

摘要

本发明公开了一种分泌表达外源蛋白的酵母转化子及其制备方法，所述方法步骤为：正向引物5’端引入XhoI，对应Kex2识别区域P1’位点分别引入20种氨基酸密码子，反向引物5’端引入NotI，得20对引物；以目标基因CDS序列cDNA或DNA为模板扩增，TA克隆得载体群P1’-CDS-pMD20-T；构建酵母真核表达载体群P1’-CDS-pPICZαA；转化载体群至酵母，筛选阳性转化子，并接到YPD平板，得相同拷贝数的转化子群甲醇诱导，分析蛋白产量，即得表达水平最高的转化子。本发明制备方法通过对Kex2的P1’氨基酸残基的优选以提高Kex2蛋白酶识别底物的活性，从而提高酵母分泌表达重组蛋白的产量。

主权项

一种分泌表达外源蛋白的酵母转化子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计克隆外源基因CDS的引物：正向引物的5’端引入XhoI位点，并在对应于Kex2蛋白酶识别区域的P1’位点分别引入20种天然氨基酸的密码子，反向引物的5’端引入NotI位点，得20对系列引物；（2）TA克隆感兴趣的外源基因CDS：以含有步骤（1）所述20对系列引物感兴趣的目标基因完整CDS序列的cDNA或者DNA为模板，用步骤（1）所述系列引物扩增出完整的CDS基因片段，回收PCR产物TA连接入TA克隆载体pMD20‑T，得到系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pMD20‑T，经过测序验证所有载体P1’位点氨基酸密码子与设计相同，且外源基因CDS确定为正确的可表达序列；（3）亚克隆构建酵母真核表达载体群：将步骤（2）所得的载体群P1’‑CDS‑pMD20‑T和酵母表达载体pPICZαA，分别经XhoI和NotI双酶切消化并回收，用Solution I连接试剂连接，得系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pPICZαA；（4）转化重组载体群至酵母宿主中：将步骤（3）所得的系列P1’变化载体群P1’‑CDS‑pPICZαA经SacI单酶切线性化后，回收酶切产物，再经氯化锂转化法转入毕赤酵母Pichia pastoris的X‑33宿主菌中，经zeocin90‑110μg/ml筛选得到阳性转化子；（5）确定酵母转化子拷贝数：将步骤（4）所得的阳性转化子转接到含zeocin浓度递增的YPD平板，获得具有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’‑CDS；（6）酵母转化子的液体培养及甲醇诱导表达：将步骤（5）所得的有相同外源基因整合拷贝数的转化子群P1’‑CDS及空载转化子接种至BMGY培养基，25‑30℃摇床培养至OD600为1.8‑2.2，收集酵母细胞用BMMY培养基重悬，稀释至OD600为0.9‑1.1，甲醇诱导110‑130h，离心并收集上清；（7）筛选表达水平最高的重组载体转化子：通过分析步骤（6）所得的上清中外源重组蛋白产量，即得表达水平最高的P1’氨基酸的重组载体转化子。