[发明专利]一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法

摘要

本发明涉及一种酶的筛选方法，特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶。本发明使用深孔板进行微型化培养，实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备；突破性的利用pH的变化来筛选高酶活的卤醇脱卤酶，效率高，成本低、速度快；消耗的培养基和试剂少；本发明使得可机械化自动化操作以实现，借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量，提高筛选通量。

主权项

一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法，其特征在于：用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶，其包括如下步骤：（1）将含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落稀释后接种于装有液体培养基深孔板的多个孔中，在摇床中进行两次培养；（2）将深孔板超低温冷冻然后室温融化，至少重复进行2次；（3）将前述经过冻融的深孔板进行离心处理，取上清液为粗酶液；（4）将粗酶液和含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落分别加入不同个装有反应底物和去离子水及pH指示剂混合液的反应管中，将加入含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落的反应管作为参照管，在相同条件下反应，筛选出比参照管颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落，完成初筛；（5）将初筛所得的卤醇脱卤酶单菌落对应的粗酶液分别加入不同个装有反应底物、去离子水混合液的反应管中，用pH计在线监测各管内体系的pH的变化，同样以含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落反应管作为参照管，复筛出单位时间内pH变化量比参照管大的卤醇脱卤酶单菌落，即为高酶活的卤醇脱卤酶；初筛和复筛的反应底物均为（S）‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯和氰化钠的混合物，（S）‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的浓度为10‑50毫摩每升，氰化钠的浓度为10‑80毫摩每升；初筛所用的pH指示剂为1.0g/l溴甲酚紫钠盐和1.0g/l的溴百里酚蓝钠盐水溶液的混合指示剂。