[发明专利]牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法

摘要

本发明公开了一种牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法。首先通过分子克隆方法克隆获得包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子序列，亚克隆至pMD19-T-Promoter载体，再利用KpnI和XhoI限制性内切酶双酶切后，将其产物纯化回收，并连接在pGL3-Basic质粒上，转化大肠杆菌JM109，挑取鉴定后的阳性克隆子，进行大量制备和保藏。此法构建的包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子的荧光素酶质粒（pGL3-Basic-Promoter），可转染细胞，进行启动子功能活性分析，以筛选出高效的组织特异性启动子，克服目前动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目的不足及调控能力较弱的缺陷。

主权项

1.一种牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）利用生物信息学软件分析牛FATP1基因5’侧翼启动子序列，预测出核心启动子序列和转录因子结合位点；（2）根据pGL3-Basic真核表达载体中多克隆位点区，结合已获得启动子片段以及限制性内切酶酶切反应效率，选取Kpn和Xho两种限制性内切酶酶切位点用于构建pGL3-Basic-Promoter真核表达载体；设计带有酶切位点的特异性引物，将酶切位点分别加在上下游引物的5’端，并在酶切位点的5’端添加2～3个保护性碱基；（3）将包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子序列插入pMD19-T载体，构建包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子序列的pMD19-T-Promoter载体；（4）将牛FATP1基因启动子片段插入pGL3-Basic载体的Kpn与Xho位点间，构建牛FATP1基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic-Promoter。