[发明专利]一种假俭草总DNA提取方法

摘要

本发明公开了一种假俭草总DNA的提取方法，涉及分子生物学领域中植物提取总DNA的技术。其主要步骤是:向研磨成细粉状的假俭草叶片中加入细胞核提取缓冲液，经硅珠进行DNA吸附、洗脱及DNA纯化，析出。本发明使用硅珠，能有效吸附出DNA，去除多糖、多酚、色素和蛋白质等次生代谢物质，提取得到高质量的假俭草总DNA。本发明能从低温保存的假俭草组织和新鲜组织中提取高质量的假俭草总DNA。本发明适用于假俭草高质量总DNA的提取。

主权项

一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于：具体操作步骤如下：（1）称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心管中；（2）在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14μL β‑巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65℃水中温浴30min，期间颠倒混匀5‑6次；（3）将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速11000rpm离心15min，吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；（4）在1.5mL离心管中加入150μL 硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止10min后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠‑核酸复合物；（5）将步骤（4）得到硅珠‑核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混匀，置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠‑核酸复合物；（6）重复步骤（5）一次；（7）将步骤（6）得到的硅珠‑核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，加入1mL 70%酒精将硅珠‑核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠‑核酸复合物自然风干；（8）向装有步骤（7）得到的硅珠‑核酸复合物的离心管中加入100μL TE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使之充分分散，在56℃水中温浴10min后，置于离心机在转速11000rpm离心5min，吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中,得到分离物硅珠和上层清液；（9）将步骤（8）中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入100μL TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56℃温浴10min，置于离心机在转速12000rpm离心5min，吸取上层清液，装入步骤（8）中上层清液的1.5ml离心管；将该离心管置于离心机在转速12000rpm离心10min，吸取上层清液，并加入400μL TE缓冲液，充分混匀，得到混合液；（10）向装有步骤（9）的混合液的离心管中加入600μL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在转速12000rpm离心10min；吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；（11）重复步骤（10）一次；（12）向装有步骤（11）得到的上层清液的离心管中加入3M, pH为5.2的60μL NaAC，再加入600μL在‑20℃预冷的异丙醇，置于离心机在转速10000rpm离心15min；倒掉上层清液，得到下层的DNA；（13）在步骤（12）中得到的DNA，加入700μL体积浓度70%的酒精洗DNA，置于离心机在转速10000rpm离心5min，倒掉上层清液，得到下层的DNA；（14）重复步骤（13）两次；（15）向步骤（14）中得到的DNA加入700μL 无水乙醇，进行清洗，置于离心机在转速10000rpm离心5min，倒掉上层清液，并用黄枪头吸干酒精，得到纯化DNA；（16）将步骤（15）得到的纯化DNA置于室温自然风干，然后向其加入200μL TE缓冲液溶解，保存在‑20℃冰箱中。