[发明专利]制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用

摘要

本发明提供一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，包括：将体细胞在细胞培养液A中培养1-3天；在细胞培养液B中继续培养1-6天；然后在细胞培养液C中继续培养1-6天；以及收集雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞；本发明还提供了一种用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试剂盒。使用本发明的方法及试剂盒在非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的产量、纯度、生产速度方面具有显著优势。

主权项

一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，包括：将体细胞在细胞培养液A中培养1‑3天；在细胞培养液B中继续培养1‑6天；然后在细胞培养液C中继续培养1‑6天；以及收集雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞；其中所述培养液A是RPMI1640培养液，其中含有：1‑100μM的RHO激酶抑制剂Y‑27632(C₁₄H₂₁N₃O.2HCl)；1‑100ng/ml的干细胞因子；1‑100ng/ml的白细胞介素3；1‑100ng/ml的白细胞介素6；1‑100ng/ml的白细胞介素11；1‑100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)；1‑100ng/ml的粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)；1‑100μg/ml的岩藻多糖；1‑100μg/ml的葡聚糖硫酸酯；1‑100nM的AMD 3100(1，1′‑[1，4‑亚苯基二(亚甲基)]‑二‑1，4，8，11)；1‑100μM的M‑阿仑膦酸钠(M‑ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)；以及1‑100μM的氨羟二磷酸二钠；其中所述培养液B是DMEM培养液，其中含有：1‑100μM的RHO激酶抑制剂Y‑27632(C₁₄H₂₁N₃O·2HCl)；1‑100μM的1‑磷酸‑神经鞘氨醇；1‑100μg/ml的骨形态发生蛋白2(BMP‑2)；1‑100μg/ml的生长分化因子‑5(GDF‑5)；1‑1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；1‑1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；100‑10000IU/ml的促红细胞生成素(EPO)；1‑200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)；1‑1000ng/ml的干细胞因子；1‑1000ng/ml的白细胞介素3；1‑1000ng/ml的白细胞介素6；1‑1000ng/ml的白细胞介素11；1‑1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)；1‑1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)；1‑1000ng/ml的激活素A(activin A)；1‑100μM的烟酰胺；1‑1000ng/ml的神经营养因子(NT4)；1‑1000ng/ml的脑源性神经营养因子(BDNF)；1‑1000ng/ml的角质化细胞生长因子(KGF)；1‑1000ng/ml的神经生长因子(NGF)；1‑1000ng/ml的类胰岛素生长因子‑1(IGF‑1)；以及1‑1000μg/ml的地塞米松；其中所述培养液C是M16培养液，其中含有：1‑100μM的RHO激酶抑制剂Y‑27632；1‑1000ng/ml的支持细胞特异蛋白(AMH)；1‑1000ng/ml的I型类固醇原生生长因子(SF1)；1‑1000ng/ml的Y染色体性别决定区(Y染色体性别决定基因(SRY))；1‑100μg/ml的高泳动家族性别决定基因9(SOX9)；1‑1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；1‑1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；3000IU/ml的促红细胞生成素(EPO)；1‑200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)；1‑100ng/ml的干细胞因子；1‑100ng/ml的白细胞介素3；1‑100ng/ml的白细胞介素6；1‑100ng/ml的白细胞介素11；1‑1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)；1‑1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)；1‑1000ng/ml的激活素A(activin A)；1‑100μM的烟酰胺(Nicotinamide)；1‑1000ng/ml的表皮生长因子(EGF)；1‑1000ng/ml的神经营养因子(NT4)；1‑1000ng/ml的脑源性神经营养因子(BDNF)；1‑1000ng/ml的角质化细胞生长因子(KGF)；1‑1000ng/ml的神经生长因子(NGF)；1‑1000ng/ml的类胰岛素生长因子‑1(IGF‑1)；1‑1000ng/ml的生长因子；以及1‑100μg/ml的地塞米松。